本方法公开了一种测定硫普罗宁浓度的方法。以由结构式（１）表示的对溴苯乙酰基溴对样品中硫普罗宁进行化学衍生化之后，再采用高效液相色谱法测定硫普罗宁衍生物。此方法能排除其他物质对硫普罗宁的干扰，采用通用型的液相色谱柱和紫外检测器即可对硫普罗宁进行高效液相色谱测定，线性范围１０～１０００ｎｇ，最小检出量３．３ｎｇ。血浆中硫普罗宁回收率７０％以上，ＲＳＤ小于１５％。本发明专利技术可十分准确地用于血浆、尿液、脑脊液、生物组织等生物材料以及原料药和制剂中硫普罗宁浓度的定量测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属分析化学领域，具体涉及一种经化学衍生化后利用液相色谱法定量测定硫普罗宁的方法。
技术介绍
硫普罗宁(Tiopronin)，分子式为HS-CH(CH3)-CONH-CH2-COOH。硫普罗宁首先在日本上市，而后德、意、美、瑞士等国家相继作为改善肝功能药物应用临床。国外长期使用证实该药能全面、明显改善病毒性肝炎、酒精性肝损伤的肝功能指标及有关症状，具有疗效确切、安全可靠等特点。硫普罗宁用于慢性肝炎的辅助治疗，安全性高，多数不良反应轻微且短暂。已报道的硫普罗宁浓度的测定方法有分光光度法、化学发光法、电化学氧化后安培检测法、流动注射荧光检测法和伏安法，这些方法操作繁琐且灵敏度和专属性差；衍生化后气相色谱联用质谱法，仪器费用昂贵，且重现性差，难以在大多数分析实验室中实施。
技术实现思路
本方法的目的是提供一种简便而准确的测定样品中硫普罗宁浓度的方法。本专利技术的技术方案通过如下方法和步骤施行取待测样品(血浆、尿液、脑脊液、生物组织等生物材料以及制剂和原料药)，加入稳定剂，再加入过量的衍生化试剂和催化剂反应，加入定量的提取溶剂进行液液提取进行样品处理，漩涡，离心，取有机相吹干，用定量复溶试剂复溶，用液相色谱法测定硫普罗宁衍生物的浓度。本专利技术所述的样品进行预处理，采用蛋白沉淀、稀释过滤、液液萃取或固相萃取。上述测定硫普罗宁浓度的方法中，加入的稳定剂为EDTA-2Na和微生素C。上述测定硫普罗宁浓度的方法中，加入的催化剂为0.1mol/L NaOH。上述测定硫普罗宁浓度的方法中，加入的提取溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、苯、甲苯或三氯甲烷。上述测定硫普罗宁浓度的方法中，加入的复溶试剂为乙腈。上述测定硫普罗宁浓度的方法中，所用衍生化试剂为通式(1)的对溴苯乙酰基溴。 上述测定硫普罗宁浓度的方法中，所用反应溶剂为水、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、甲苯、苯、乙醚、乙酸乙酯、二甲亚砜或石油醚。上述测定硫普罗宁浓度的方法中，采用液相色谱-紫外检测器测定硫普罗宁衍生物的峰面积，用标准曲线校正方程换算成硫普罗宁的浓度。上述测定硫普罗宁浓度的方法中，采用通用型的液相色谱柱，其填料为十八烷基键合相硅胶、辛烷基键合相硅胶或者氰基键合相硅胶。本专利技术方法能排除其他物质对硫普罗宁的干扰，采用通用型的液相色谱柱和紫外检测器即可对样品中硫普罗宁进行高效液相色谱测定，本方法简便、准确、可靠，线性范围10~1000ng，最小检出量3.3ng，线性相关系数r＝0.9989，RSD小于15％，平均回收率70％以上。本方法可用于血浆、尿液、脑脊液、生物组织等生物材料以及制剂和原料药中硫普罗宁浓度的定量测定。附图说明图1为典型色谱图，其中A空白血浆；B血浆中硫普罗宁衍生物对照品；C血浆样品。图2为典型色谱图，其中A空白；B制剂样品；C硫普罗宁衍生物对照品。具体实施例方式实施例1色谱条件美国Angilent HP-1100型高效液相色谱仪，包括在线脱气、四元泵、柱温箱、紫外检测器、惠普色谱工作站及20μL手动进样系统；色谱柱Diamonsil TMC18(150×4.0mm I.D.，5μm)；柱温30oC；流动相pH1.8三氟乙酸水溶液-乙腈60∶40；流速1.0mL/min；检测波长263nm。样品制备 取血浆样品1mL，精密加入内标溶液40μL(50μg/mL奥沙普秦)，加入0.5mg/mL p-BPB甲醇液(对溴苯乙酰基溴，2，4’-Dibromacetophenon，化学式4-(Br)C8H4COCH2Br)40μL，再加入0.1mol/L NaOH 40μL，摇匀，避光室温放置30min，加入1mol/L HCl 400μL，摇匀，加入乙酸乙酯5mL，漩涡振荡2min，8000rpm高速离心15min后，取上层有机相，用氮气吹干，残渣加入80μL乙腈复溶，然后取20μL进样作HPLC测定。线性试验取空白血浆1mL，分别加入硫普罗宁对照品溶液，使血浆浓度分别为0.04、0.2、0.4、1、2、3和4μg/mL，以下按“样品制备”项处理。以衍生物峰面积与内标峰面积之比(Y)，对药物浓度(C，ng/mL)进行线性回归，计算结果为Y＝0.05192×C-0.0122(r＝0.9989，n＝7)。精密度和回收率试验取空白血浆1mL，分别加入硫普罗宁标准溶液，配制高、中、低三个浓度点(0.04、0.4和4μg/mL)的标准血样，每个浓度点平行5份，以下按“样品制备”项处理。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差，精密度以相对标准偏差(RSD)表示，(C实测/C理论)×100％即为回收率。表1是精密度和回收率试验结果。表1 实施例2样品制备取尿样1mL，精密加入内标溶液40μL(50μg/mL奥沙普秦)，加入0.5mg/mLp-BPB甲醇液(对溴苯乙酰基溴，2，4’-Dibromacetophenon，化学式4-(Br)C8H4COCH2Br)40μL，再加入0.1mol/L NaOH 40μL，摇匀，避光室温放置30min，加入1mol/L HCl 400μL，摇匀，加入乙酸乙酯5mL，漩涡振荡2min，8000rpm高速离心15min后，取上层有机相，用氮气吹干，残渣加入80μL乙腈复溶，然后取20μL进样作HPLC测定。线性试验分别加入硫普罗宁对照品溶液，使血浆浓度分别为0.04、0.2、0.4、1、2、3和4μg/mL，以下按“样品制备”项处理。以衍生物峰面积与内标峰面积之比(Y)，对药物浓度(C，ng/mL)进行线性回归，计算结果为Y＝0.0788×C-0.0065(r＝0.9978，n＝7)。实施例3样品制备取内含硫普罗宁的制剂少许称重，以25ml乙腈溶解，过滤并用乙腈洗涤不溶物，合并滤液及洗涤液于100ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度。取溶液100μL，加入0.5mg/mL p-BPB甲醇液(对溴苯乙酰基溴，2，4’-Dibromacetophenon，化学式4-(Br)C8H4COCH2Br)40μL，再加入0.1mol/L NaOH 40μL，摇匀，避光室温放置30min，加入0.1mol/L HCl 40μL，然后取20μL进样作HPLC测定。线性试验精密分别取1、5、10、50、100、200μg/mL硫普罗宁标准溶液100μL，按“样品制备”项处理。以衍生物峰面积对硫普罗宁浓度进行线性回归，其回归方程为A＝65.95C-28.93，相关系数r＝0.9997。权利要求1.，其特征是包括下述步骤1)取待测样品，加入稳定剂，2)加入过量的衍生化试剂和催化剂反应，3)加入定量的提取溶剂进行样品预处理，4)复溶试剂复溶，5)液相色谱法测定硫普罗宁衍生物的浓度。2.根据权利要求1所述的测定硫普罗宁浓度的方法，其中所述的待测样品包括血浆、尿液、脑脊液、生物材料以及制剂和原料药。3.根据权利要求1所述的测定硫普罗宁浓度的方法，其特征是所述的稳定剂为EDTA-2Na和微生素C。4.根据权利要求1所述的测定硫普罗宁浓度的方法，其特征是所述的的催化剂为0.1mol/L NaOH。5.根据权利要求1所述的测定硫普罗宁浓度的方法，其特征是所述的的提取溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、苯、甲苯或三氯甲烷。6.根本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定硫普罗宁浓度的方法，其特征是包括下述步骤：１）取待测样品，加入稳定剂，２）加入过量的衍生化试剂和催化剂反应，３）加入定量的提取溶剂进行样品预处理，４）复溶试剂复溶，５）液相色谱法测定硫普罗宁衍 生物的浓度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：段更利，黄滔敏，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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