鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法技术

一种鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术首先将Ｈ９Ｎ２型禽流感病毒进行扩增，获得目的片断，将该片断与载体连接，得到重组表达质粒，导入大肠杆菌表达，获得一个融合蛋白；该融合蛋白经过纯化，得到Ｈ９Ｎ２型禽流感病毒ＮＳ１蛋白，将该蛋白作为抗原包被酶标反应板，建立酶联免疫吸附试验方法测定待检血清中与抗原反应的抗体水平，通过统计学分析确定酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值、最少的检测样本数；最后根据鸡群样本的酶联免疫吸附试验平均ＯＤ值大小，从群体水平鉴别诊断鸡群是否被禽流感野毒感染。本发明专利技术方法从总体鉴别诊断，降低了非特异性反应，为及时诊断、预防禽流感提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物工程
的方法，具体是一种。
技术介绍
禽流感，尤其是HPAI(高致病性禽流感)，对禽类养殖业具有很大的危害。目前有效控制禽流感的方法之一是疫苗接种，有效评价免疫效果的一个指标就是检测免疫后的抗体水平，因此有效区分自然感染产生的抗体与免疫接种产生的抗体非常重要。传统的血清学诊断禽流感的方法有HA-HI(血凝和血凝抑制试验)、AGP(琼脂免疫扩散)、微量中和以及NIF(神经氨酸酶抑制试验)，由于这些方法所检测的抗体，不管是接种疫苗还是感染野毒均会产生，因此这些检测方法不能真实反映禽流感的实际感染情况，给防控禽流感带来极大的困难。 经对现有技术的文献检索发现，王泽霖等在《中国科技》(2006年213卷14-17页)发表的题为“非结构蛋白NS1-酶联免疫吸附试验检测禽流感野毒感染抗体”论文，及杨涛等在《中国兽医科技》(2005年25卷585-589页)发表的题为“H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白的原核表达及其酶联免疫吸附试验检测方法的建立”的论文，都对利用禽流感非结构蛋白(NS1蛋白)作为包被抗原，通过酶联免疫吸附试验的方法，在个体水平上检测鸡血清中针对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括：　　　　①通过反转录聚合酶链式反应扩增Ｈ９Ｎ２型禽流感病毒ＮＳ１蛋白的基因；　　　　②将步骤①扩增所得Ｈ９Ｎ２型禽流感病毒ＮＳ１蛋白的基因通过酶切插入到载体质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）中，构建出原核表达质粒，将构建好的质粒转入大肠杆菌ＢＬ２１中，异丙基巯基半乳糖苷诱导表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹实验鉴定为融合蛋白；　　　　③将步骤②所得融合蛋白作为抗原包被酶标反应板，建立酶联免疫吸附试验的方法，确定反应条件；　　　　④按照步骤③建立的酶联免疫吸附试验的方法，对禽流感Ｈ９Ｎ２感染组鸡血清、３０日...

【技术特征摘要】
1.一种鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括①通过反转录聚合酶链式反应扩增H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因；②将步骤①扩增所得H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因通过酶切插入到载体质粒pET-32a(+)中，构建出原核表达质粒，将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21中，异丙基巯基半乳糖苷诱导表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹实验鉴定为融合蛋白；③将步骤②所得融合蛋白作为抗原包被酶标反应板，建立酶联免疫吸附试验的方法，确定反应条件；④按照步骤③建立的酶联免疫吸附试验的方法，对禽流感H9N2感染组鸡血清、30日龄非免疫鸡的阴性血清、禽流感H9N2灭活疫苗接种组鸡血清进行检测；⑤按照统计学方法对检测结果进行分析，确定禽流感血清的酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值和最少样本数；⑥根据血清样本酶联免疫吸附试验阴阳性判定的临界值和规定的最少检测样本数，按照鸡群血清样本的酶联免疫吸附试验平均吸光度的大小，平均吸光度高于临界值的确定为鸡群感染了禽流感野毒。2.根据权利要求1所述的鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征是，步骤②中所述的融合蛋白，其分子量为44.2KD。3.根据权利要求1所述的鉴别诊断禽流感感染鸡群的酶联免疫吸附试验方法，其特征是，步骤③中所述的酶联免疫吸附试验，其反应条件为抗原的包被浓度为40μg/mL，抗体的稀释倍数为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建和，王琰，陆承平，严亚贤，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]