本发明专利技术涉及能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组ＶａｃＡ单克隆抗体的杂交瘤细胞系，特别涉及对该杂交瘤细胞用同系小鼠体内诱生法获得抗幽门螺杆菌重组ＶａｃＡ蛋白的单克隆抗体。可与幽门螺杆菌重组ＶａｃＡ蛋白特异性结合，制备的ＶａｃＡ单克隆抗体作为包被抗体可用于生产诊断ＶａｃＡ产毒株感染的ＥＬＩＳＡ试剂盒，也可作为被动免疫制剂用于治疗ＶａｃＡ产毒株感染，在科研上还可用免疫组织化学的方法，研究ＶａｃＡ的致病机制，具有巨大的商业价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组单克隆抗体，特别涉及一种幽门螺杆菌重组VacA单克 隆抗体及其应用。
技术介绍
自1983年Warren和Marshall从胃粘膜组织中发现幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori, Hp)以来,大量研究已经表明该菌是引起慢性胃炎 和胃溃疡的最常见原因，在胃溃疡的复发及胃癌的发生中起到重要作用。 Hp的感染非常普遍，发展中国家高于发达国家，发展中国家流行特征为儿童 期易感型，婴幼儿甚至出生几个月的新生儿都可能受到感染，并以每年 3-10%的速度上升，因各种体检未将Hp感染的检查作为常规指标，多为引 起临床症状就诊时才发现， 一旦感染，将终身受累，自愈率几乎为零。感 染者中慢性胃炎的发病率为45-85%、消化性溃疡为10-20%、胃癌和淋巴瘤 为40. 61/10万。在我国普通人群中的感染率为50-80%，并以每年1-2%的 速度增加。预防Hp感染，对保护人群健康具有重要的现实意义。目前，已发现Hp的毒力因子有多种，如鞭毛、黏附因子、尿素酶、蛋 白水解酶、毒素相关蛋白、细胞空泡毒素(vacuolating cytotoxinA， VacA) 等，其中VacA是一种重要的致病物质。1988年，Leunk首先发现Hp具有使真核细胞空泡变性的毒素，并命名为细胞空泡毒素(VacA)。1992年，Cover 和Blaster提纯了该毒素。大多数学者认为VacA属于A-B型结构的细菌毒 素，即37000Da片段是毒性亚单位，58000Da片段是结合亚单位。其致病 机理尚未完全明了，多认为VacA可通过受体介导的内吞作用进入细胞内， 引起内吞作用障碍，最终导致细胞内空泡样变性；同时能够在胞浆膜上形 成通道与增强极化上皮单层细胞的渗透性，导致细胞死亡。流行资料表明 虽然50%-60%人群感染Hp,但临床上仅有15%的感染者出现症状。Hp的其他 毒力因子几乎存在所有的菌株，因此不能解释Hp感染后的不同临床表现。 而编码VacA的基因存在所有菌株中，但只有50%-60%菌株表达，感染者是 否出现临床症状与感染菌株的毒力有关。因此诊断VacA产毒株感染在临床 上具有重要意义，针对VacA的防治措施也具有重要价值。编码vacA基因的DNA大约3. 8kb。 Atherton等发现Hp的vacA基因 内存在三种不同的信号区序列(sla, slb， s2)和两种不同的中间区序列(ml， m2)，据此可将Hp分为不同的vacA基因亚型。vacA基因型有很强的地区 差异性，研究表明我国基因型大多为slm2型。纪徐准等对五株有代表性的 中国Hp菌株进行vacA基因测序，然后用比较基因序列差异距离的方法分 析，发现四株中国m2型vacA基因彼此相似，其基因差异距离明显不同于 同型西方菌株。编码毒性亚单位及输出段的基因在中国菌株间彼此相似， 而与西方菌株相比则形成独立的一组。由于vacA基因呈多态性，导致表达 蛋白结构的差异。因此针对中国株的vacA基因产物用于诊断和防治更适合国内临床。现有技术已成功地表达了 VacA重组蛋白，并鉴定其具有良好的抗原性 与免疫原性，由于制备方法的烦琐及各种影响因素的存在，目前尚未制备 出重组VacA单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是(1):提供一种能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA 单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZYA2、 ZYB5、 ZYC8、 ZYD4及一种利用该杂交瘤 细胞用同系小鼠体内诱生法获得的抗幽门螺杆菌重组VacA蛋白的单克隆 抗体(针对中国株的重组VacA单克隆抗体)。(2)、提供该单克隆抗体在制 备诊断VacA阳性株感染的ELISA试剂盒中的应用以及幽门螺杆菌重组VacA 单克隆抗体在制备相应疫苗和治疗VacA阳性株感染的试剂中的应用。 采用的具体技术方案如下-一种能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞 系ZYA2、 ZYB5、 ZYC8、 ZYD4，它们由以下步骤制得采用基因工程诱导表 达获取的幽门螺杆菌VacA重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠 的脾细胞、活性大于95%的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，克隆筛 选能持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述免疫小鼠脾细胞与活性大于95%的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按10: 1比例进行细胞融合，细胞融合时所用促进剂PEG的分子量是4000，浓度 是50%，细胞融合后置于96孔板中培养。在其制备步骤中于杂交瘤细胞融合后7-10天开始检测培养上清中的 抗体。所述的杂交瘤细胞用同系小鼠腹腔接种体内诱生法获得抗幽门螺杆菌 重组VacA蛋白的单克隆抗体。其中腹腔接种杂交瘤细胞的剂量1 X 107毫升，体积是0. 5毫升。 整个制备工艺流程如附图1所示 VacA重组蛋白的制备通过BLAST对纪徐准测序的五株有代表性的中国Hp菌株毒性亚单位进 行同源性比较，得到一个高度同源的基因片段为目的基因。以Hp (AF050320) 标准株的vacA基因序列为依据设计引物，以临床菌株基因组为模板，经 PCR扩增，从vacA基因中扩增出毒性片段V，克隆至原核表达载体PQE-30 中，转化表达菌DH5ci大量诱导表达。重组质粒PQE-30-V的序列分析表明，所得序列完整，与文献中国菌株 相比有高度的同源性。重组质粒转化表达菌DH5a大量诱导表达后，用 N;T-NTA树脂提纯表达蛋白，SDS-PAGE分析可见单一条带，图象软件分析 表明纯度可达93%以上。Western blot鉴定NC膜显色后在相对分子量27000 处出现相应的条带，大小与预期的一致，表明重组蛋白具有良好的抗原性； Bradford法测定重组蛋白含量为0. 8mg/ml;用Helico Blot试剂盒检测重 组蛋白的兔抗血清与免疫前正常血清鉴定，可见重组蛋白的兔抗血清VacA 抗体呈阳性，而对照为阴性，表明重组蛋白具有良好的免疫原性。此重组质粒PQE-30-V保存于本实验室。本专利技术采用杂交瘤技术制备抗幽门螺杆菌重组细胞空泡毒素VacA毒 性片段的单克隆抗体，取得了成功，在制备过程中应用到以下关键技术A. 免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合比例本专利技术选用免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合比例为 10: 1。B. 融合促进剂的选择本专利技术选用分子量为4000，浓度为50%的PEG作为融合促进剂。 原理细胞融合是实验的中心环节。融合时选用PEG作为融合促进剂， PEG分子量1000 — 6000均可用，最好用4000。 PEG的典型浓度范围为30% 一50%,低于30%融合率低，高于50%时有毒性。PEG的分子量为4000时， 以30%， 40%, 50%三种浓度作比较，结果表明50%的融合率相对较高而毒性 相对不大，可作为细胞融合的适宜浓度。当PEG的浓度增加到50%时，PEG 可能与邻近膜的水分相结合，使细胞之间只有几个埃的空间水分被代替， 由此降低细胞表面的极性，导致脂双层不稳定，引起细胞膜的融合。同时， 为保证融合的成功，骨髓瘤细胞的活性也相当重要，只有活性大于95%时， 才能保证融合的成功。本专利技术所用的PEG分子量为4000，浓度为50%，获 得良好融合效果。值得注意的是在操作过本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能持续稳定分泌幽门螺杆菌重组ＶａｃＡ单克隆抗体的杂交瘤细胞系ＺＹＡ２、ＺＹＢ５、ＺＹＣ８、ＺＹＤ４，它们由以下步骤制得：采用基因工程诱导表达获取的幽门螺杆菌ＶａｃＡ重组蛋白为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，将免疫小鼠的脾细胞、活性大于９５％的ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，克隆筛选能持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨致邦，张绍兰，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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