本发明专利技术提供了菌株糖蜜草固氮螺菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｅｌｉｎｉｓ ＴＭＣＹ０５５１９），保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５８０。它是采用选择性培养基在厌氧和好氧培养条件下，对生长于珠海酸性土壤的糖蜜草根、茎、叶中的内生固氮菌进行分离、纯化得到的，具有耐酸、高固氮酶活性，可作为接种剂促进糖蜜草及禾本科作物生长。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种内生固氮新菌株，尤其涉及一种耐酸、高固氮酶活性内生固氮细菌新种(Azospirillum melinis TMCY 05519)及其应用。
技术介绍
糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv.)是热带地区的一种优良牧草，它能在酸性和贫瘠的土壤上作为先锋植物种植。内生固氮菌是一类具有固氮能力的微生物，它的主要宿主是非豆科作物。人们在研究内生固氮菌时发现某些菌类能提供植物高达80％的氮量。发掘内生固氮菌的资源已成为非豆科作物高效利用生物固氮战略的主攻方向之一。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术的目的旨在提供具有耐酸、高固氮酶活性的内生固氮菌株及其应用。(二)技术方案本专利技术通过采用选择性培养基在厌氧和好氧培养条件下，对生长于珠海酸性土壤的糖蜜草根、茎、叶中的内生固氮菌进行分离、纯化，得到固氮螺菌属的一个新种，经过研究发现它具有耐酸、高固氮酶活性，可作为接种剂促进糖蜜草及禾本科作物生长。本专利技术所述的糖蜜草固氮螺菌(Azospirillum melinis TMCY 05519)已于2005年12月26日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1580。本专利技术糖蜜草固氮螺菌具有如下形态和生理、生化特性a、菌体形态特性糖蜜草固氮螺菌的细胞为革兰氏阴性菌，杆状或卷曲，大小为(0.7-0.8)×(1.0-1.5)μm。b、菌落形态特性在Nfb固体培养基平板上培养72h后，菌落形态为圆形或圆锥状，表面光滑呈粘液状，边缘整齐，透明，菌落大小为2-3mm。c、主要生理生化特性兼性厌氧，能在以糊精、D-纤维二糖、龙胆二糖、m-肌醇、麦芽糖、松二糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、D-葡萄醛酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天氡酰氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、D-丝氨酸、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-蜜二糖、D-甘露糖、D-棉子糖、L-棉子糖、D-山梨醇、D-海藻糖、D-丙氨酸、丙三醇、吐温40、乳果糖、蔗糖、β-羟基苯乙酸、奎尼酸、吐温80、D，L-乳酸、L-丝氨酸作为唯一碳源的培养基上生长，不能在以赤藻糖醇、木糖醇为碳源的培养基上生长。该菌株的16S rDNA序列如SEQ1所示。本专利技术糖蜜草固氮螺菌的分子分类地位的确定采用细菌16S rDNA基因通用引物25f和1492r进行扩增，将PCR产物直接进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank进行比对，结果发现本专利技术的糖蜜草固氮螺菌属于固氮螺菌属，与产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)模式菌株DSM 1691有97.5％的相似性。SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS-PCR指纹图谱分析表明，本专利技术的糖蜜草固氮螺菌TMCY 05519与产脂固氮螺菌DSM 1691存在着较大差异。进一步的DNA/DNA杂交结果表明糖蜜草固氮螺菌TMCY 05519与产脂固氮螺菌DSM 1691的DNA同源性为55.6％，G+C％为68.7％。结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列分析、SDS-PAGE全细胞蛋白电泳图谱、IS-PCR指纹图谱分析和DNA/DNA杂交结果，本专利技术的糖蜜草固氮螺菌应归属于固氮螺菌属(Azopsirillum sp.)，是该属的一个新种，命名为糖蜜草固氮螺菌(Azospirillum melinis)。其判断参考如下文献Ben Dekhil S，et al.Syst Appl Microbiol，1997，2072-77；Eckert B，et al.，Int J Syst Evol Microbiol，2001，5117-26；Khammas K M，Researchin Microbiology，1989，140679-694；Krieg N R，Dobereiner J，GenusAzospirillum In Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology，1，1984，pp.94-104；Reinhold B，et al.International Journal of Systematic Bacteriology，1987，3743-51；Sly L I，Stackebrandt E，Int J Syst Bacteriol，1999，49541-544；Tarrand J J，Canadian Journal of Microbiology，1978，24967-980；Xie C H，Yokota A，Int J Syst Evol Microbiol，2005，551435-1438. 本专利技术菌种的分离纯化方法如下将生长于珠海酸性土壤的新鲜糖蜜草样本用蒸馏水洗净，然后剪下根、茎、叶并分别置于已灭菌的三个培养皿中，用3％的双氧水(H2O2)浸泡4min(以除去根、茎、叶表面的腐烂物质)，无菌水洗涤一次，再用0.1％的升汞(HgCl2)浸泡5min，无菌水中振动洗涤5-7次，每次5-10min，并将最后一次洗涤液涂布于固休培养基，以检测消毒是否彻底。将表面消毒完全的根、茎、叶用已灭菌手术刀切碎，分别接种到三支装有5mlNfb半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于28℃的人工培养箱内进行培养。整个操作均在无菌条件下完成。待长出菌体后，向管内注入1/10体积10％乙炔气体(终浓度为1％)，在相同条件下再培养24h，测定其固氮酶活性(乙炔还原法)。将具有固氮酶活性的菌株从半固体管中接至相应的固体培养基上，平板划线分离，28℃，湿度为85％条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落分别接种至半固体培养基试管中，以检测固氮酶活性，再涂平板直到获得纯的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态及确定纯化与否。Nfb培养基构成malic acid(苹果酸)5.0g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 0.1g/L，CaCl20.02g/L，0.5％ bromthymolblue 2.0mL/L(先溶解在0.2N KOH溶液中)，vitamin solution(维生素液)1.0mL/L，micronutrient solution(微量元素液)2.0mL/L，1.64％ Fe-EDTAsolution 4.0mL/L，KOH 4.5g/L，pH＝6.8。其中vitamin solution(维生素液)组成为biotin(生物素)100.0mg/L，pyridoxol-HCl(盐酸吡哆醇，维生素B6)200.0mg/L；micronutrient solution(微量元素液)组成为CuSO40.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.12g/L，H2BO31.4g/L，Na2MoO4·2H2O 1.0g/L，MnSO41.5g/L(固体培养基中加入1.7％的琼脂，半固体培养基中加入0.15-0.25％的琼脂)。本专利技术的菌种可作为接种剂以促进糖蜜草及禾本科作物生长。如可将分离纯化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48小时，菌数达2.5×109，CFU.mL-1，用蛭石作载体。将糖蜜草固氮螺菌液与蛭石(2∶1)混合本文档来自技高网...
【技术保护点】
糖蜜草固氮螺菌菌株（ＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｍｅｌｉｎｉｓＴＭＣＹ０５５１９），保藏号为ＣＧＭＣＣＮｏ．１５８０，其特征在含有如ＳＥＱ１所示的１６ＳｒＤＮＡ序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谭志远，彭桂香，王华荣，张国霞，侯伟，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。