【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种dna探针组合、荧光传感器及其在肿瘤亚型外泌体分离与检测中的应用。
技术介绍
1、近年来的研究已经确立了细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)作为细胞间通讯的一种高效手段的作用。外泌体(exosome)是细胞分泌的一种细胞外囊泡，直径约为30-150纳米(nm)。人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，外泌体遍布全身，存在于血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁、精液、腹腔积液、关节滑液等生物体液中。外泌体携带有多种蛋白质、脂类、dna和rna等重要信息，因此通过外泌体的转移能够实现细胞间的物质运输和信息传递。
2、从肿瘤免疫逃避到神经退行性变，evs涉及广泛的病理生理状况。特别是肿瘤细胞主动分泌大量的evs，提供与周围和远处细胞的细胞间通讯，肿瘤源性细胞外囊泡(tumorcell-derived extracellular vesicles,tevs)可以促进肿瘤进展，在肿瘤发生的几乎所有方面发挥重要作用。然而，tevs在循环生物体液中的丰度很低，其信号通常埋藏在大量异质evs中。目前，大多数evs检测方法往往涉及操作复杂的纯化步骤和专用设备，不适合在科研和临床应用中高效操作，而且大多数分析方法只能用于鉴定evs的单一生物标志物，这也降低了evs分析的特异性，这阻碍了evs在癌症诊断中的临床应用。此外，特定亚型evs的富集分离对于tevs的量化和癌症的诊断也非常关键。现阶段，超高速(100,000g)离心是分离evs最常用的技术，需要使用超高速离心机，但它效率低
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种dna探针组合、荧光传感器及其在肿瘤亚型外泌体分离与检测中的应用，用于解决现有技术中外泌体分析所存在的富集困难，检测方式复杂等问题。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种dna探针组合，包括第一探针(即spd-l1)、第二探针(即sepcam)和第三探针(即slink)，所述第一探针含有能特异性结合细胞程序性死亡配体1(pd-l1)蛋白的第一核酸适配体，所述第二探针含有能特异性结合上皮细胞粘附分子(epcam)蛋白的第二核酸适配体；所述第三探针分别与所述第一探针和第二探针的部分序列互补，并通过互补寡核苷酸杂交与所述第一探针和第二探针结合形成拉链状正交结构；基于所述正交结构带来的邻位效应，所述第一探针和第二探针部分区域的核酸序列会自组装形成g-四链体(g4)结构。
3、在一些实施例中，所述第一核酸适配体为mj5c适配体，所述mj5c适配体的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4、在一些实施例中，所述第一核酸适配体为syl3c适配体，所述syl3c适配体的核苷酸序列如seq id no.5所示。
5、在一些实施例中，所述第一探针、第二探针和第三探针的核苷酸序列依次如seqid no.1～3所示。
6、本专利技术第二方面提供一种荧光传感器，所述荧光传感器包括荧光检测体系，所述荧光检测体系包括第一方面所述的dna探针组合，还包括荧光配体，所述荧光配体能与所述g-四链体(g4)结构结合。
7、在一些实施例中，所述荧光配体为硫磺素(tht)。
8、在一些实施例中，所述第一探针和第二探针上均修饰有荧光基团，所述荧光基团包括但不局限于fam、hex、rox、cy3、cy5等。
9、在一些实施例中，所述荧光检测体系还包括外泌体；在一些具体实施方式中，所述外泌体来自于待测样本，所述待测样本包括但不局限于血清、血液等。
10、在一些实施例中，所述荧光检测体系还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液至少包括tbs缓冲液、kcl，但不局限于此。
11、在一些实施例中，所述荧光传感器用于富集分离与定性定量检测肿瘤亚型外泌体。
12、在一些实施例中，所述荧光传感器产生的荧光信号强度与所述肿瘤亚型外泌体的数量成正比。
13、本专利技术第三方面提供一种肿瘤亚型外泌体免超离富集分离方法，采用第一方面所述的dna探针组合或第二方面所述的荧光传感器，所述第一探针中的第一核酸适配体与外泌体上的细胞程序性死亡配体1(pd-l1)蛋白特异性结合，所述第二探针中的第二核酸适配体与外泌体上的上皮细胞粘附分子(epcam)蛋白特异性结合，以对外泌体进行分子标记；所述第三探针分别与所述第一探针和第二探针的部分序列互补，从而使被标记的外泌体与外泌体之间相互交联，进而使同时表达细胞程序性死亡配体1(pd-l1)和上皮细胞粘附分子(epcam)蛋白的外泌体自组装聚合形成外泌体簇；通过离心方式分离获取所述外泌体簇，所述外泌体簇即为肿瘤亚型外泌体。
14、在一些实施例中，所述方法包括如下步骤：将第一探针、第二探针、第三探针与外泌体混合孵育，得所述外泌体簇；孵育结束后离心，弃上清。
15、在一些实施例中，离心力为8000～12000g。
16、在一些实施例中，第一探针、第二探针、第三探针与外泌体混合孵育的温度为37℃。
17、在一些实施例中，第一探针、第二探针、第三探针与外泌体混合孵育的时间为60～120min。
18、在一些实施例中，在将第一探针、第二探针、第三探针与外泌体混合孵育前，对第一探针和第二探针进行变性退火处理；在一具体实施方式中，变性温度为95℃，变性时间为5min。
19、在一些实施例中，所述方法还包括如下步骤：将所述外泌体簇与荧光配体混合避光孵育，进行荧光检测，基于获取的荧光信号对待测样品中的外泌体进行定性定量分析。
20、在一些实施例中，避光孵育温度为37℃。
21、在一些实施例中，避光孵育时间为2～10min。
22、在一些实施例中，荧光检测时激发波长为425nm，发射波长为445～600nm，电压为600v。
23、本专利技术第四方面提供根据第一方面所述的dna探针组合和/或根据第二方面所述的荧光传感器和/或根据第三方面所述的方法在制备肿瘤亚型外泌体分离与检测试剂中的应用。
24、如上所述，本专利技术的dna探针组合、荧光传感器及其在肿瘤亚型外泌体分离与检测中的应用，具有以下有益效果：
25、(1)基于本专利技术提出的技术方案可以构建一种高灵敏度的无超高速离心分离策略，同时对tevs进行无标记检测，该策略使用双核酸适配体和g4结构，使用拉链状正交结构，将tevs锚定的dna链交联形成三维网络簇，增加了tevs的体积和质量，从而通过普通离心可以方便地富集tev。
26、(2)本专利技术提供的dna探针组合组装形成的g4结构能特异性地与荧光配体(如硫磺素tht)分子结合，从而产生荧光；并且该g4结构能作为zippers-like molecular trap(zmt)，显著增强g4-tht的荧光信号本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种DNA探针组合，其特征在于，包括第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针含有能特异性结合细胞程序性死亡配体1蛋白的第一核酸适配体，所述第二探针含有能特异性结合上皮细胞粘附分子蛋白的第二核酸适配体；所述第三探针分别与所述第一探针和第二探针的部分序列互补，并通过互补寡核苷酸杂交与所述第一探针和第二探针结合形成拉链状正交结构；基于所述正交结构带来的邻位效应，所述第一探针和第二探针部分区域的核酸序列会自组装形成G-四链体结构。
2.根据权利要求1所述的DNA探针组合，其特征在于，具有以下特征(Ⅰ)至(Ⅱ)中的至少一个：
3.根据权利要求2所述的DNA探针组合，其特征在于：所述第一探针、第二探针和第三探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示。
4.一种荧光传感器，其特征在于：所述荧光传感器包括荧光检测体系，所述荧光检测体系包括权利要求1～3任一项所述的DNA探针组合，还包括荧光配体，所述荧光配体能与所述G-四链体结构结合。
5.根据权利要求4所述的荧光传感器，其特征在于：所述荧光配体为硫磺素ThT。
6.根据
7.一种肿瘤亚型外泌体免超离富集分离方法，其特征在于：采用权利要求1～3任一项所述的DNA探针组合或权利要求4～6任一项所述的荧光传感器，所述第一探针中的第一核酸适配体与外泌体上的细胞程序性死亡配体1蛋白特异性结合，所述第二探针中的第二核酸适配体与外泌体上的上皮细胞粘附分子蛋白特异性结合，以对外泌体进行分子标记；所述第三探针分别与所述第一探针和第二探针的部分序列互补，从而使被标记的外泌体与外泌体之间相互交联，进而使同时表达细胞程序性死亡配体1和上皮细胞粘附分子蛋白的外泌体自组装聚合形成外泌体簇；通过离心方式分离获取所述外泌体簇，所述外泌体簇即为肿瘤亚型外泌体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：将第一探针、第二探针、第三探针与外泌体混合孵育，得所述外泌体簇；孵育结束后离心，弃上清。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：离心力为8000～12000g。
10.根据权利要求1～3任一项所述的DNA探针组合和/或权利要求4～6任一项所述的荧光传感器和/或根据权利要求7～9任一项所述的方法在制备肿瘤亚型外泌体分离与检测试剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种dna探针组合，其特征在于，包括第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针含有能特异性结合细胞程序性死亡配体1蛋白的第一核酸适配体，所述第二探针含有能特异性结合上皮细胞粘附分子蛋白的第二核酸适配体；所述第三探针分别与所述第一探针和第二探针的部分序列互补，并通过互补寡核苷酸杂交与所述第一探针和第二探针结合形成拉链状正交结构；基于所述正交结构带来的邻位效应，所述第一探针和第二探针部分区域的核酸序列会自组装形成g-四链体结构。
2.根据权利要求1所述的dna探针组合，其特征在于，具有以下特征(ⅰ)至(ⅱ)中的至少一个：
3.根据权利要求2所述的dna探针组合，其特征在于：所述第一探针、第二探针和第三探针的核苷酸序列依次如seq id no.1～3所示。
4.一种荧光传感器，其特征在于：所述荧光传感器包括荧光检测体系，所述荧光检测体系包括权利要求1～3任一项所述的dna探针组合，还包括荧光配体，所述荧光配体能与所述g-四链体结构结合。
5.根据权利要求4所述的荧光传感器，其特征在于：所述荧光配体为硫磺素tht。
6.根据权利要求4所述的荧光传感器，其特征在于，具有以下特征(...
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