一种靶向叶酸受体α的单链抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向叶酸受体α的单链抗体及其应用，属于肿瘤靶向治疗领域，所述叶酸受体α单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2中的CDR区如SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.8所示。本发明专利技术所述的叶酸受体α单链抗体序列由噬菌体展示技术筛选所得，经原核表达系统表达抗体分子，可用于靶向叶酸受体α表达阳性的肿瘤细胞。本发明专利技术可利用所获得的单链抗体分子在肿瘤诊断中发挥潜在的医学和药学价值，为肿瘤的靶向治疗提供一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向叶酸受体α的单链抗体及其应用
本专利技术涉及生物
，涉及一种叶酸受体α特异性结合的单链抗体及其在肿瘤靶向中的应用。
技术介绍
噬菌体展示技术是将外源多肽或重组蛋白与噬菌体的衣壳蛋白进行融合表达，使外源蛋白能展示在病毒颗粒表面，同时使编码外源蛋白的DNA位于该病毒粒子内。天然人源噬菌体展示单链抗体文库是将人抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)通过一段linker序列连接到一起，融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，构建为一个组合文库。所展示的单链抗体(ScFv)表达在pIII的N末端，再用各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)来进行体外筛选获得具有与靶蛋白结合活性的噬菌体克隆。体外选择程序简单来说就是噬菌体抗体库与固相靶分子共孵育，洗涤去除未结合噬菌体，然后再用特殊的洗脱液洗脱得到能与靶分子特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体还需进行扩增，进行下一轮的结合/扩增循环，来富集特异性结合噬菌体。经3～4轮“淘选”后，通过DNA测序可以得到每个特异性结合的序列。叶酸受体(folatereceptor，FR)是结合并转运叶酸及其衍生物进入细胞的重要转运体，在体内主要以三种亚型存在：FRα、β和γ。叶酸受体α(folatereceptorα，FRα)是一种由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜表面的糖蛋白。已有文献报道，卵巢癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等组织中FRα呈高表达，而在正常组织中限制性表达，因此被认为是极具潜力的卵巢癌标志物或肿瘤相关抗原(TAA)；FRα对卵巢癌具有的高度特异性，可作为治疗相关肿瘤的靶点；部分研究也表明，FRα对于卵巢癌的早期诊断具有重要价值。基于此，若能得到与FRα具有较高亲和力的单链抗体序列，将为肿瘤的靶向性治疗和诊断提供新思路。本实验室前期成功构建了一个库容为2×109的全人源噬菌体单链抗体文库，可用FRα蛋白固相亲和筛选以获得特异性靶向的噬菌体克隆。
技术实现思路
为了解决上述问题；本专利技术提供了一种靶向叶酸受体α的单链抗体，本专利技术利用噬菌体展示技术从本实验室自主构建的全人源噬菌体单链抗体文库中筛选获得一种能与FRα特异性结合的噬菌体克隆；将该噬菌体克隆所展示的单链抗体基因克隆到工程菌内，构建原核表达系统，以可溶性表达的形式大量制备单链抗体；该单链抗体可用于靶向FRα表达阳性的肿瘤细胞。本专利技术的技术方案是：一种靶向叶酸受体α的单链抗体，所述单链抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，所述的SEQIDNO.1为：CAGGCGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAGGGCGGTTGGTCGGGGGTGGCGGTTTTGGGGCCAAGGTACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGCGGTTCTGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGATATTGTGCTGACTCAGTCTCCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATTATGTATACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCTCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGTCGGCGCGGGTATTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAACGT。一种靶向叶酸受体α的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步的，所述的SEQIDNO.2为：QAQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAVGRGWRFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVSDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSARVFGGGTKVDIKR。进一步的，所述单链抗体SEQIDNO.2中CDR区氨基酸序列如SEQIDNO.3-SEQIDNO.8所示。进一步的，所述SEQIDNO.3-SEQIDNO.8具体如下：SEQIDNO.3：GFTFSSYA；SEQIDNO.4：SSNIGSNY；SEQIDNO.5：ISGSGGST；SEQIDNO.6：RNN；SEQIDNO.7：ARRAVGRGWRF；SEQIDNO.8：AAWDDSLSARV。一种药物组合物，包含所述的氨基酸序列与药物活性成分通过共价或非共价偶联，或包含所述的氨基酸序列的递药载体。一种分子探针，所述分子探针包含所述的氨基酸序列。进一步的，所述的核苷酸序列及所述氨基酸序列在肿瘤靶向治疗中的应用。进一步的，所述的氨基酸序列在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。本专利技术具体为：(1)、全人源噬菌体单链抗体文库的亲和筛选：以FRα重组蛋白为靶标，对单链抗体噬菌体展示库进行四轮生物筛选；每轮筛选检测回收率和多克隆ELISA，以判断筛选是否有效；通过单克隆ELISA检测各克隆与FRα重组蛋白的结合能力；(2)、噬菌体阳性单克隆DNA的测序鉴定：根据上述ELISA结果，选择阳性值高的噬菌体单克隆，对其进行测序，且对各个序列进行生物信息学分析；(3)、流式细胞术检测噬菌体抗体与天然细胞表面FRα的结合：选取FRα表达阳性的细胞株SKOV3(人卵巢癌细胞)，检测噬菌体抗体与细胞株的结合；(4)、FRScFv原核表达系统的构建：首先设计PCR引物，扩增出FRScFv的基因，获取目的基因片段，通过酶切、酶连反应将扩增出的单链抗体基因插入到pET22b载体中，并在目的基因下游融合组氨酸(His)标签，构建出单链抗体的重组表达载体；将重组载体转化入宿主菌中，经过菌落PCR验证，测序分析，挑取测序正确的克隆即为构建成功的表达FRScFv的工程菌；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向叶酸受体α的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向叶酸受体α的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的一种靶向叶酸受体α的单链抗体，其特征在于，所述的SEQIDNO.1为：
CAGGCGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAGGGCGGTTGGTCGGGGGTGGCGGTTTTGGGGCCAAGGTACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGCGGTTCTGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTCGGATATTGTGCTGACTCAGTCTCCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATTATGTATACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCTCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGTCGGCGCGGGTATTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAACGT。
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【专利技术属性】
技术研发人员：邱郑，王旻，陶慧敏，邢黎军，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32