一种具有中和作用的人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种具有中和作用的人鼠嵌合抗Siglec‑15全分子IgG及其制备方法及其应用，属于生物制药领域；本发明专利技术使用Siglec‑15特异性多肽免疫小鼠，采用杂交瘤技术制备鼠源抗Siglec‑15单克隆抗体，并采用基因工程技术和抗体工程技术，制备重组人鼠嵌合抗Siglec‑15全分子IgG；该嵌合抗体可有效识别Siglec‑15胞外区特异性氨基酸片段，并抑制Siglec‑15蛋白与Sialyl‑Tn蛋白的结合；本发明专利技术公开了一种人鼠嵌合抗Siglec‑15全分子IgG，包含轻链可变区和重链可变区，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；本发明专利技术还公开了上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种具有中和作用的人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG及其制备方法和应用
本专利技术属生物制药领域，涉及一种人鼠嵌合抗Siglec-15的全分子IgG抗体，还涉及上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。
技术介绍
唾液酸结合Ig样凝集素家族，即Siglecs家族，是经典的免疫球蛋白样凝集素蛋白家族。在生理条件下，只有15种Siglec分子在介导免疫抑制的髓细胞和免疫细胞表面表达，具有免疫抑制特性。当Siglecs识别所有哺乳动物细胞表达的含唾液酸的聚糖时，可以帮助免疫细胞区分自我和非自我。而唾液酸化病原体也可以通过Siglec依赖的相互作用破坏和促进免疫应答，或者下调免疫细胞反应并逃避免疫监视。Siglecs在免疫细胞激活和抑制受体的调节中具有重要作用，它可以影响宿主-病原体的相互作用、神经变性、自身免疫性疾病调节破骨细胞分化和癌症。由于其在免疫细胞上的表达受限、内吞特性和调节受体信号的能力，已成为细胞定向治疗的重要靶点。其中，Siglec-15作为细胞表面跨膜受体，由免疫球蛋白(Ig)样结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成。免疫球蛋白样结构域由2个胞外Ig域组成，包括一个包含唾液酸结合位点的N端V-set域和2型恒定区(IgC2)区组成。其通过其跨膜结构域中的带正电荷的氨基酸与酪氨酸的激活基序(ITAM)适配器分子DAP12缔合，并通过募集SYK激酶激活受体。根据系统发育分析，Siglec-15不同于其他家族成员。它显示出与B7-H1以及许多其他B7家族成员相似的结构域成分和高度同源性。更重要的是，Siglec-15和B7-H1在人肺癌组织中的表达是互斥的，故Siglec-15除了可能与B7家族成员一样，除了具有免疫调节功能之外，可能还具有一种独特的调节机制：Siglec-15除了与TCR以及CD44结合之外，未发现Siglec-15与其他受体结合，并且不与B7-H1、PD-1、B7-1或任何其他已知的B7家族配体或受体相互作用。癌细胞表面高表达异常的多糖成分并分泌多糖聚合物的特性也使肿瘤多糖图谱作为癌症临床生物标记物，广泛用于癌症的诊断。Siglecs识别肿瘤相关sTn抗原的特性使得越来越多的靶向Siglecs或糖基化配体的治疗药物被相继研发并用于淋巴瘤、白血病和自身免疫疾病等多种Siglecs相关疾病的治疗。肿瘤细胞表面唾液聚糖的微结构域导致癌症免疫逃逸，使得肿瘤生长、侵袭和转移能力增强。Siglec-15在多种人类肿瘤组织中表达于肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)上。体外实验进一步证明了其在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导的M2样巨噬细胞中的表达显著增加。Siglec-15与12kDa的接头蛋白DNAX激活蛋白(DAP12)结合在跨膜区的结合决定簇Lys(274)上，并将信号转导至脾脏酪氨酸激酶(Syk)。Syk抑制剂处理THP-1细胞或将Siglec-15Lys(274Lys)替换为ALA，从而破坏Siglec-15与DAP12之间的分子相互作用，可显著抑制THp-1细胞TGF-β的分泌。这些结果表明，Siglec-15优先识别肿瘤的sTn抗原，并在TAMs中传递促进TGF-β分泌的信号，进一步提示巨噬细胞上的Siglec-15可能通过TGF-β介导的肿瘤内微环境的调节而促进肿瘤的进展。肿瘤细胞上的sTn抗原与一些分子(可能包括Siglec-15)在M-CSF诱导的巨噬细胞上相互作用，从而促进TGF-β的产生，进而影响肿瘤的发展。目前已公布的以Siglec-15为靶点的抗体中，多数以诊断和科学研究为主，尚无明确可以与Siglec-15胞外区特定氨基酸区域结合的报道，且兼具抑制或阻断Siglec-15结合功能的抗体。本专利技术所制备的抗体，可有效与Siglec-15蛋白胞外区特异性片段结合，并阻断其与sTn蛋白的结合，显示了良好的中和特性，且尚无相关功能的抗Siglec-15抗体专利报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种具有中和作用的人鼠嵌合抗Siglec-15抗体IgG，以及该抗体CDR区域的核酸及氨基酸序列，抗体可变区核酸及氨基酸序列，抗体全分子氨基酸序列，抗原结合表位氨基酸序列，制备鼠源抗Siglec-15抗体的方法，人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG的方法，及其对抑制Siglec-15与sTn蛋白的结合反应中的用途。本专利技术提供一种人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG，抗体轻链可变区的核酸序列为SEQIDNO.1所示，抗体重链可变区的核酸序列为SEQIDNO.2所示。抗Siglec-15抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示，抗Siglec-15抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。抗Siglec-15抗体轻链全长核酸序列(含恒定区)为SEQIDNO.5，氨基酸序列为SEQIDNO.7；重链全长核酸序列(含恒定区)为SEQIDNO.6，氨基酸序列为SEQIDNO.8。抗Siglec-15抗体轻链抗原互补区CDR的核酸序列为SEQIDNO.9，SEQIDNO.10，SEQIDNO.11；氨基酸序列为SEQIDNO.15，SEQIDNO.16，SEQIDNO.17所示。抗Siglec-15抗体重链抗原互补区CDR的核酸序列为SEQIDNO.12，SEQIDNO.13，SEQIDNO.14；氨基酸序列为SEQIDNO.18，SEQIDNO.19，SEQIDNO.20所示。抗原结合表位氨基酸序列为至少一个下述氨基酸序列：SEQIDNO.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23所示。本专利技术提供一种人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG抗体，包括轻链可变区以及重链可变区，所述轻链可变区的核酸序列为SEQIDNO.1所示，所述重链可变区的核酸序列为SEQIDNO.2所示。进一步的，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。进一步的，所述轻链可变区的抗原互补区CDR的核酸序列分别为SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11所示；所述重链可变区的抗原互补区CDR的核酸序列分别为SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14所示。进一步的，所述轻链可变区的抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17所示；所述重链可变区的抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20所示。本专利技术提供一种DNA分子，其编码上述全分子IgG抗体的重链或/和轻链。进一步的，所述轻链核酸序列为SEQIDNO.5所示，所述重链核酸序列为SEQIDNO.6所示。进一步的，所述轻链氨基酸序列为SEQIDNO.7所示，所述重链氨基酸序列为SEQIDNO.8所示。本专利技术提供一种表达载体，包含有上述DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。本专利技术提供一种在真核细胞中表达蛋白的方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG抗体，包括轻链可变区以及重链可变区，其特征在于：所述轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG抗体，包括轻链可变区以及重链可变区，其特征在于：所述轻链可变区的核酸序列为SEQIDNO.1所示，所述重链可变区的核酸序列为SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的一种人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG抗体，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。


3.根据权利要求1或2所述的一种人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG抗体，其特征在于：所述轻链可变区的抗原互补区CDR的核酸序列分别为SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11所示；所述重链可变区的抗原互补区CDR的核酸序列分别为SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14所示。


4.根据权利要求1或2所述的一种人鼠嵌合抗Siglec-15全分子IgG抗体，其特征在于：所述轻链可变区的抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17所示；所述重链可变区的抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20所示。


5.一种DNA分子，其编码权利要求1-4任一项所述的全分子IgG抗体的重链或/和轻链。


6.根据权利要求5所述的DNA分子，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐奇，毛圆，唐小军，冯振卿，朱进，肖雪筠，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32