一种切伦科夫荧光成像探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种切伦科夫荧光成像探针及其制备方法与应用，探针为

【技术实现步骤摘要】
一种切伦科夫荧光成像探针及其制备方法与应用
本专利技术属于领域，具体涉及一种切伦科夫荧光成像探针及其制备方法与应用。
技术介绍
分子成像方法已被广泛用于研究体内的发生的各种生物事件，因为分子成像方法使研究人员能够在分子水平上非侵入性地研究活体中的疾病发生、发展和转归。目前已经开发出了多种分子成像方式以了解在活的小动物和患者中疾病的功能和解剖信息。分子成像方法包括核医学成像(例如PET和SPECT)、光学成像(生物发光和荧光)、磁共振成像、超声和计算机断层扫描。其中，光学成像方法的优点是灵敏度高，成本低，易于使用，相对较高的通量和较短的采集时间。光学成像仪器和分子探针的最新进展使其成为小型动物研究的极佳工具，其中，切伦科夫发光成像(Cerenkovluminescenceimaging,CLI)一种新兴的光学成像(OpticalImaging,OI)，作为一种新的临床前成像工具来研究体内的许多病理情况。它基于对高能带电粒子(例如电子或正电子)在介质内高速运动，运动速度快于介电介质中的光速时，粒子可以使周围的分子极化，随后发出的一种以短波长为主的电磁辐射，其特征是蓝色辉光，这就是所谓的切伦科夫辐射(Cerenkovradiation,CR)。CR由帕维尔·阿列克谢耶维奇·切连科夫于1932年发现，如果在生物组织传播的粒子的能量大于约220keV这一阈值，则会发生这种现象。CR光谱由紫外光、可见光和近红外范围内的连续波长组成，强度分布与波长的平方成反比。可以通过各种光敏检测器来检测发出的光子，例如光电倍增管，高灵敏度电荷耦合器件(CCD)等。由于微弱的发射，生物组织中的检测非常具有挑战性。伯奇在1971年进行了非常初步的尝试，他用光电倍增管在用32P治疗的人眼肿瘤中检测到CR，但此方法随后未采用，也没有进行成像。现在开发了CLI的不同应用程序，并进行了许多努力以增加该技术的潜力。尽管具有这些优点，但由于组织穿透能力差以及美国食品药品管理局批准的光学成像探针数量有限，因此CLI成像在临床应用方面存在局限性。另一方面，核成像方式具有高灵敏度，良好的组织穿透性，出色的定量性和易于转化为临床应用的优势。虽然在过去的几十年中，核成像方式和放射性碘(radioiodine，RI)已广泛用于临床甲状腺病学和肿瘤研究。但是，核成像方式也有一些缺点，例如空间和时间分辨率低，以及购买和维护仪器的成本高。因此，它对基础研究人员的可及性受到限制。所以，我们针对CLI成像这一新兴成像方法，进行了一些有益的专利技术研究。CRC是全世界最常见的癌症之一，占所有恶性肿瘤的10％。结直肠癌的早期诊断、精准治疗以及及时的预后评估是影响癌症治疗效果及患者结局的重要因素。而传统的癌症治疗和靶向治疗的患者通常会出现耐药性。癌症免疫疗法很可能成为癌症临床治疗的关键。免疫检查点阻断(Immunecheckpointblockade,ICB)已成为一种很有前途的癌症免疫治疗方法。针对PD-1/PD-L1的单克隆抗体的免疫疗法，通过结合配体或受体，阻断PD-1和PD-L1相互作用，在多种癌症中显示了显著的临床疗效，包括结直肠癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤。肿瘤中程序性死亡配体-1(PD-L1)的表达已被用作预测抗PD-L1免疫治疗反应的生物标记。PD-L1的无创性检测可作为指导和监测免疫治疗的一个重要的生物学标志物。因此本专利技术公开制备结直肠癌PD-L1表达的光学显像剂NIR-PD-L1-mAb，意在对CRC患者进行PD-L1靶向免疫治疗选择和治疗反应的评估提供了有价值的诊断信息。现有的技术有：免疫组织化学技术：应用免疫组化检测PD-L1表达是第一个临床认证的预测PD-1/PD-L1抑制剂反应的生物标志物，免疫组织化学测定PD-L1的表达水平能够直接反映患者对PD-L1抑制剂应答率。正电子发射断层显像(PET)技术和单光子计算机断层扫描的PD-L1检测：靶向PD-1/PD-L1的PET显像常用于标记单克隆抗体的正电子核素包括64Cu(半衰期12.7h)、68Ga(半衰期68.1min)、89Zr(半衰期3.7d)。靶向PD-1/PD-L1的SPECT显像，用于标记PD-1/PD-L1靶向显像剂的单光子核素包括111In(半衰期67.3h)和99mTc(半衰期6.02h)可以无创、全面显示PD-L1的表达。流式细胞仪(flowcytometry)：是将现代光电测量、电子计算机、电子物理和细胞荧光化学及抗体等技术融合为一体，经常应用于生命科学研究领域的仪器。它是利用该仪器对快速直线运动状态中的生物颗粒或单细胞进行多参数定性分析或定量分析。该仪器也可以从细胞群体中分选和富集具有相同荧光信号的某些特定亚群。使用流式细胞仪对细胞株进行PD-L1表达的检测是根据细胞表面的蛋白抗原与相应的带荧光的抗体结合后，流式细胞仪通过激发相应的荧光染料发出荧光，通过对比检测到的荧光幅度来衡对比细胞表面该蛋白的表达量。可溶性PD-L1的检测：PD-L1表达阳性的细胞系上血清中可以检测到高浓度的sPD-L1，而且sPD-L1的含量与mPD-L1的表达强度有关，由此推测sPD-L1是mPD-L1剪切形成的，并且两者的生物学功能相似，且都可以与T细胞表面PD-1受体结合，导致T细胞失活，负向调控免疫系统。近期的研究发现，与膜结合的PD1和PD-L1具有可溶性形式，这些可溶性形式增加了PD-1/PD-L1信号通路功能及构成的复杂性和多样性。对sPD-L1的水平一般可采用酶联免疫吸附法进行检测，循环sPD-L1水平同样可以作为NSCLC患者接受抗PD-1/PD-L1治疗的生物标志物。液态活检：是指对外周血中循环的游离成份进行分子基因信息的研究和分析。这些游离成份包括CTC(circulatingtumorcell，CTC)，循环肿瘤DNA，循环miRNA以及肿瘤细胞释放的外泌体等。循环肿瘤细胞CTC：是指从原发病灶脱落进入外周血的肿瘤细胞，在肿瘤的转移中扮演着非常重要的角色。它作为液态活检领域的主要成员，代表着部分原发肿瘤的细胞生物信息。CTC的出现提供了非侵入型、治疗相关的诊断以及判断预后的方法，作为携带有原始肿瘤病灶和转移病灶的生物学信息，能完整全面地反映肿瘤组织中PD-L1表达的情况。CTC连续的检测为耐药相关的基因突变的识别提供了机会，免除需要反复操作而病人获益。但是，到目前为止，很少有用于直接快速检测结直肠癌PD-L1的切伦科夫荧光成像分子探针。因此合成一个基于结直肠癌PD-L1表达水平的高选择性、高灵敏度的切伦科夫荧光成像分子探针具有重大的意义。本申请人利用Na131I与PD-L1mAb通过氧化还原反应，成功制备光学显像剂131I-PD-L1mAb，用来示踪PD-L1过度表达的肿瘤细胞。利用多种结直肠癌小鼠移植瘤模型，验证131I-PD-L1mAb探针的特异性切伦科夫成像能力。在切伦科夫光成像实验中可以观察到，引入探针后，PD-L1过度表达的肿瘤有明显荧光信号，肿瘤区所发射的光子数明显高于对侧的正常组织，说明探针在肿瘤区特异性聚集。该技术是安全的，可为肿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种切伦科夫荧光成像探针，其特征在于，所述探针为

【技术特征摘要】
1.一种切伦科夫荧光成像探针，其特征在于，所述探针为131I-PD-L1mAb，其化学式为：





2.一种切伦科夫荧光成像探针的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤a、将摩尔比为87:13的Na2HPO4·12H2O与NaH2PO4·2H2O用ddH2O配置为磷酸盐缓冲液，调节pH值至7.6；
步骤b、将酪氨酸溶解于步骤a得到的磷酸盐缓冲液，配置成10mg/ml的酪氨酸磷酸盐溶液；
步骤c、将0.2mol/L的磷酸盐缓冲液加入到氧化剂涂布的微型离心管内，再加入抗PD-L1单克隆抗体，混匀后，加入Na131I再次混匀，室温反应10-15min，期间每隔3min混匀一次；
步骤d、反应完成后加入酪氨酸磷酸溶液终止反应，室温静置10min；
步骤e、纯化：20mmol/L的磷酸盐缓冲液内加入含有复合氨基酸的蛋白作为蛋白质保护剂，混匀后调节pH到7.4，配置成0.3％牛血清白蛋白-磷酸盐洗脱液，反应所得产物加入PD-10预装脱盐柱纯化，0.5ml每等试样进行等分，测定每份的放射性计数，合并放射性计数高的峰管，得到131I-PD-L1mAb。


3.根据权利要求2所述的一种切伦科夫荧光成像探针的制备方法，其特征在于，所述步骤c中混匀是通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜慧杰，赵升，潘文斌，蔺雪，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23