一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用，提供了具有生物学活性的抗小鼠CD226单克隆抗体FMU‑mCD226.1的轻链和重链可变区，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。通过常规杂交瘤技术和CD226基因敲除小鼠制备了一株小鼠抗小鼠CD226单克隆抗体，筛选出能稳定分泌高特异性的抗小鼠CD226 mAb的杂交瘤细胞株FMU‑mCD226.1，制备腹水获得高特异性、高亲和力的抗小鼠CD226 mAb，可以应用于免疫印迹、免疫荧光染色和流式细胞术检测。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；为研制和开发抗小鼠CD226分子诊断和治疗试剂提供技术支持。

A highly specific monoclonal antibody against mouse CD226 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用
本专利技术属于生物医学
，涉及一种单克隆抗体，尤其是一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用。
技术介绍
免疫球蛋白超家族成员CD226分子是一种广泛表达于多种免疫细胞膜表面的I型跨膜糖蛋白，分子量约67KD，其胞膜外区含有2个免疫球蛋白V样结构域。CD226分子又称血小板与T细胞活化抗原1(plateletandTcellactivationantigen1,PTA1)，最早是澳大利亚Burns教授等于1985年发现并命名，1996年美国DNAX研究所克隆出该分子基因，将其命名为DNAX辅助分子1(DNAM-1)。CD226分子是一个在进化上保守的分子，不同种属间CD226分子在核苷酸水平和氨基酸水平高度同源，在组织和细胞类型的表达分布也极为相似，提示该分子在机体免疫应答过程和其他生物学功能中可能扮演了重要的角色。小鼠CD226分子胞膜外区形成二硫键的2对半胱氨酸高度保守，与人类CD226分子同样具有IgV样结构域的特征性结构(Asp-Xaa-Gly-Ala-Xaa-Try-Xaa-Cys)，胞浆区同样具有结合含有SH2结构域分子的EDIYVNY序列。另一方面，这种高度的保守性也为我们建立相关的实验动物模型，深入研究分子作用机制提供了便利条件。2008年，美国华盛顿大学MarcoColonna教授建立了CD226基因敲除小鼠(CD226KO)，为进一步阐明CD226在体内的作用机制提供了极大的便利。既往的研究发现，在造血细胞中，CD226主要表达于活化T细胞、NK细胞、单核细胞、巨核及血小板谱系。通过与其配体PRR-2/nectin-2/CD112和PVR/necl-5/CD155的相互作用，CD226主要参与造血调控、血小板活化、免疫突触形成、细胞间黏附、T细胞和NK细胞的分化与杀伤等生物学过程，是一种重要的细胞膜活化型受体。CD226可以同T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域分子(TIGIT)竞争性结合CD155/CD112，不同的是CD226胞质区含有磷酸化位点，可以传递活化型信号，而TIGIT胞质区含有ITIM基序，传递抑制型信号。CD226同其配受体CD155之间的连接主要通过其胞膜外区的第一个免疫球蛋白V样结构域，但两个结构域的完整性对于分子间有效结合及信号转导具有重要作用。CD226分子广泛参与体内多种生理和病理过程，其基因多态性同1型糖尿病(T1DM)、系统性硬化症、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病的发生发展密切相关。CD226参与NK细胞抗肿瘤免疫过程，调控CD226和TIGIT的平衡，即促进CD226而抑制TIGIT可以产生抗肿瘤效果。外周血NK细胞CD226表达水平降低同胃癌等实体肿瘤预后不良密切相关，其同抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(iKIR)的比值可以作用预测肿瘤患者生存和预后的指标。NK细胞CD226同肿瘤细胞表达的CD155结合后可以促进叉头盒蛋白O1(Foxo1)磷酸化，进而参与NK细胞抗肿瘤免疫过程，CD226缺失或者使用抗体阻断CD226均可抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，抑制Foxo1磷酸化也可以减弱CD226介导的NK细胞杀伤作用。除了NK细胞，CD226还参与CD8+CTL细胞的免疫监视和肿瘤杀伤作用。在衰老和肿瘤发生过程中，TIGIT在CD8+T中的表达均明显增加，且TIGIT+CD8+T细胞高表达PD-1，而低表达CD226，该群细胞产生细胞因子的能力明显降低且更易凋亡，可能是衰老过程中CD8+T免疫功能低下和免疫监视功能弱化的重要原因。使用PD-1抗体可以通过抑制SRC同源序列2(SHP2)的去磷酸化恢复CD226的功能活性，且联合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)抗体可以进一步降低TIGIT表达，最终抑制CD8+T衰竭，促进对肿瘤细胞的杀伤。新近研究进一步阐明了CD226参与免疫功能调节的具体分子机制。CD226同CD155结合后可以促进蛋白激酶B(AKT)-Foxo1信号通路磷酸化，Foxo1是一种重要的转录因子，可以参与肿瘤的发生发展过程，其磷酸化促使其从胞核向胞浆转位，进而被蛋白酶体降解，CD226活化后最终抑制了Foxo1的活性。CD226是一个重要的活化型受体，应该还有其它直接的作用机制尚需阐明。另一项研究表明，CD226可以诱导VAV1酪氨酸磷酸化，同T细胞抗原识别受体(TCR)信号通路一同促进CD4+T细胞白细胞介素(IL-)17的产生。抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区不同可分为人源、鼠源等，不同种属来源的抗体在实验动物或者人体内使用时具有免疫原性，易引起机体的免疫反应，可引起对异种来源抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。小鼠是一种重要的模式实验动物，在发病机制研究和药物研发过程中具有不可替代的重要作用。配合小鼠这一模式动物的应用，为深入研究CD226分子的重要作用，需要开发相应的高亲和力和高特异性的单克隆抗体。因此，筛选出高特异性、高亲和力的鼠源性抗小鼠CD226mAb，从中克隆出轻、重链可变区基因，对进一步研制具有完全自主知识产权的小鼠CD226基因工程抗体试剂，可以应用于小鼠CD226分子功能机制的研究，以及作为诊断和免疫治疗的重要技术手段，也具有十分重要的实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为：CDR1：Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ile-Asn-Gln-Lys-Asn-Tyr；CDR2：Tyr-Trp-Ala-Ser-Thr；CDR3：Gln-Gln-Tyr-Tyr-Ser-Tyr-Pro；所述重链的可变区的3个互补决定区序列分别为：CDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Thr；CDR2：Phe-Tyr-Pro-Arg-Asp-Gly-Ser-Ser；CDR3：Cys-Ala-Arg-Tyr。优选地，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。优选地，编码轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.4所示。本专利技术还公开了上述的高特异性抗小鼠CD2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于，所述轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为：/nCDR1：Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ile-Asn-Gln-Lys-Asn-Tyr；/nCDR2：Tyr-Trp-Ala-Ser-Thr；/nCDR3：Gln-Gln-Tyr-Tyr-Ser-Tyr-Pro；/n所述重链的可变区的3个互补决定区序列分别为：/nCDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Thr；/nCDR2：Phe-Tyr-Pro-Arg-Asp-Gly-Ser-Ser；/nCDR3：Cys-Ala-Arg-Tyr。/n

【技术特征摘要】
1.一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于，所述轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ile-Asn-Gln-Lys-Asn-Tyr；
CDR2：Tyr-Trp-Ala-Ser-Thr；
CDR3：Gln-Gln-Tyr-Tyr-Ser-Tyr-Pro；
所述重链的可变区的3个互补决定区序列分别为：
CDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Thr；
CDR2：Phe-Tyr-Pro-Arg-Asp-Gly-Ser-Ser；
CDR3：Cys-Ala-Arg-Tyr。


2.如权利要求1所述的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄然，张圆，李琦，李娜，马菁昌，金伯泉，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61