抗CD20蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，提供了一种抗CD20蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。发明专利技术人还提供了抗CD20蛋白单克隆抗体的制备方法，选取人CD20氨基酸SEQ ID NO.1序列,在其氨基端添加了一个半胱氨酸后,与KLH偶联，作为免疫原。发明专利技术人还提供了一株分泌抗CD20蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系AbM58020‑32A8‑PU，保藏号为：CGMCC NO.17491。抗CD20蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CD20蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

【技术实现步骤摘要】
抗CD20蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及抗CD20蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。
技术介绍
CD20为最为特异的B细胞标记，目前应用甚为广泛的CD20单抗如美罗华之所以能对B细胞淋巴瘤有疗效，就是通过和CD20靶点结合起作用的。但需要注意的是CD20只在B细胞发育的中间阶段表达，幼稚的B细胞和终末分化的浆细胞均为阴性，它表达于细胞的胞膜。阳性区域主要是在淋巴滤泡，滤泡外的区域也可有少许阳性细胞。CD20在大多数B细胞白血病/淋巴瘤中表达，早期前体B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤可能呈阴性，慢性淋巴细胞白血病/小细胞淋巴瘤可能呈弱染色。浆细胞肿瘤通常CD20阴性，而在T细胞淋巴瘤CD20几乎都是阴性。因此，CD20对B细胞淋巴瘤和急慢性淋巴细胞白血病等有较好的细胞特异性，因此在恶性淋巴瘤尤其是T和B细胞淋巴瘤的分类上，CD20是最常用的B细胞标记物。
技术实现思路
专利技术人提供了一种抗CD20蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CD20蛋白。进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.17491的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系AbM58020-32A8-PU，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2019年04月3日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。进一步地，所述抗CD20蛋白为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。专利技术人还提供了一种抗CD20蛋白单克隆抗体的制备方法，选取CD20蛋白中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列,在其氨基端添加了一个半胱氨酸后,与载体蛋白KLH进行偶联作为免疫原。专利技术人还提供了一株分泌抗CD20蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系AbM58020-32A8-PU，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.17491。专利技术人还提供上述任一所述的抗CD20蛋白单克隆抗体，在CD20蛋白免疫检测中的用途。进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。区别于现有技术，上述技术方案依据CD20蛋白与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的氨基酸序列EPPQDQESSPIENDSSP(SEQIDNo.1)，区域作为抗原肽,在其氨基端添加了一个半胱氨酸后,偶联KLH，作为免疫源(KLH-CD20)。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CD20蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系AbM58020-32A8-PU,以及由该细胞系所分泌的抗CD20蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CD20蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。附图说明图1为AbM58020-32A8-PU杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果。图2为B细胞淋巴瘤1免疫组化染色结果图(左为AbM58020-32A8-PU的CD20，右为市售CD20)。图3为B细胞淋巴瘤2免疫组化染色结果图(左为AbM58020-32A8-PU的CD20，右为市售CD20)。图4为扁桃体组织免疫组化染色结果图(左为AbM58020-32A8-PU的CD20，右为市售CD20)。图5为阑尾组织免疫组化染色结果图(左为AbM58020-32A8-PU的CD20，右为市售CD20)。具体实施方式实施例1免疫原的制备一、抗原多肽选择依据Uniprot中登录号为P11836的蛋白质序列进行序列和二级结构分析，全长为297个氨基酸长度的CD20蛋白是MS4A家族蛋白的一部分，该家族蛋白预计跨越质膜四次，其C和N端均位于细胞内，其分子量约为33kDa左右。依据通过在线服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/预测的蛋白的二级结构(secondarystructure)和表面可及性(SurfaceAccessibility)参数，并通过对其抗原性指数(JamesonBA,WolfH.Theantigenicindex:anovelalgorithmforpredictingantigenicdeterminants.ComputApplBiosci.1988,4(1):181-6.)的分析结果，选择靠近C末端的氨基酸序列EPPQDQESSPIENDSSP作为抗原进行化学合成，为便于偶联，在该多肽的氨基端添加了一个半胱氨酸(CEPPQDQESSPIENDSSP)用于提供巯基偶联。二、多肽的偶联及纯化选择ThermoScientific的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以Ellman试剂检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100μLEllman试剂储备液，再加入10μL多肽溶液，用NanoDrop分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。开始偶联时，在每个mcKLH包装中加入200μL去离子水，配制成10mg/mL的KLH溶液，在500μL的ImjectEDC偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500μL多肽溶液加入到200μL的载体蛋白溶液中，将1mL去离子水加入到一个包装的EDC(10mg)中，缓慢振摇至完全溶解，取50μL加入到mcKLH多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未偶联的交联剂和盐类,得到免疫原CD20-KLH实施例2AbM58020-32A8-PU杂交瘤细胞系的建立一、免疫将实施例1中CD20-KLH(3.0mg/m)用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫ICR小鼠，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为30μg/只。第4次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，(用“CD20-BSA”包被，2ug/ml，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释)。效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗CD20蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗CD20蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。


3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CD20蛋白。


4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CD20蛋白中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


5.一种抗CD20蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNO.17491的杂交瘤细胞系产生。


6.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈惠玲，杨清海，陈昌星，高惠然，俞丽娜，王小亚，
申请(专利权)人：福州迈新生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35