本发明专利技术属于生物制药技术领域，涉及针对人PD1的全人源单克隆抗体、其抗原结合片段的氨基酸序列以及编码这些蛋白的核苷酸序列，相应的表达载体和能表达该抗体的宿主细胞，以及抗体Fab和IgG1形式的生产方法，所述抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的互补决定区CDR特异性基因序列决定的，并在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合PD1的抗体，利用此抗体CDR区或部分或全基因，可在原核和真核细胞及任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体，进一步用于制备预防或治疗多种类型的恶性肿瘤的药物。
【技术实现步骤摘要】
针对人细胞程序化死亡受体-1的人源单克隆抗体及其应用
本专利技术属于生物制药
，具体涉及针对人PD1(Programmedcelldeath1,PD-1)的全人源单克隆抗体、其抗原结合片段的氨基酸序列以及编码这些蛋白的核苷酸序列。
技术介绍
程序性细胞死亡蛋白(programmedcelldeath-1，PD-1)，也被称为CD279，是一种在人体中由PDCD1基因编码的蛋白质。PD-1蛋白是一个含有268个氨基酸的I型跨膜蛋白，其主要结构由胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域(2-170位氨基酸)、疏水的跨膜区(171-191位氨基酸)以及胞内区(192-288位氨基酸)组成。PD-1作为免疫球蛋白超家族的成员，是一种重要的免疫抑制分子，其主要在活化的T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞表面。研究显示，静息状态下的T细胞不表达PD-1，当T细胞被激活时，PD-1与其配体PDL1、PDL2结合后，通过mTOR以及PI3K/AKT通路抑制效应T细胞的活性、增强Treg的功能、诱导无反应性和抗原特异性T淋巴细胞的细胞凋亡，从而抑制IL-2、TNF-α和IFN-γ等的生成；肿瘤细胞正是利用这种抑制性的免疫检查点，通过表达过多的PDL1来逃避T细胞对其的识别、攻击和杀伤，从而正常的增殖和存活。单克隆抗体通过阻断PD-1与其配体的结合，从而让T细胞重新对肿瘤细胞进行杀伤。基于现有技术的基础与现状，本申请的专利技术人拟提供一种新型的anti-PD1全人源抗体，该抗体具有很高的亲和力，所述抗体可用于多种实体瘤的免疫治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于现有技术的基础与现状，提供一种新型的anti-PD1全人源抗体，具体涉及一种特异性结合PD1的全人源单克隆抗体及其氨基酸序列，本专利技术公开了编码本专利技术单克隆抗体的核苷酸序列，用于表达本专利技术中的单克隆抗体的载体和宿主细胞。本专利技术还公开了该单克隆抗体的抗原结合片段，双特异性抗体，及与效应分子的偶联物。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：1.针对人PD-1蛋白特异性单域抗体的富集筛选；2.多克隆噬菌体-酶联免疫分析检测；3.抗体的可溶表达和纯化：4.检测PD-1抗体与PD-1(ECD)-hFc蛋白的结合能力：5.单克隆抗体P2-G12的细胞结合能力通过流氏细胞术进行测定。更具体的，本专利技术提供了一种针对人PD1抗原的全人源单克隆抗体或抗原结合片段的重链和轻链的互补决定区CDR，所述的抗体的CDR区主要包含：抗体的轻链可变区含有SEQIDNO:3的CDR1，SEQIDNO:4的CDR2，及SEQIDNO:5的CDR3；抗体的重链可变区含有SEQIDNO:6的CDR1，SEQIDNO:7的CDR2，及SEQIDNO:8的CDR3；所述的针对人PD1抗原的全人源单克隆抗体或抗原结合片段包括框架区FR和上述的互补决定区CDR，所述的FR区主要包含：抗体的轻链框架区由SEQIDNO:1的1-23位，30-46位，50-85位，和/或96-105位氨基酸，及抗体的重链框架区由SEQIDNO:2的1-25位，34-50位，59-96位，和/或115-125位氨基酸；本专利技术的针对人PD1抗原的全人源单克隆抗体或抗原结合片段，是针对人PD-1表位的抗体，并且具有如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列。本专利技术公开了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如前述的CDR区，FR区，和/或所述的抗PD-1单克隆抗体；所述的多核苷酸具有如SEQIDNO:9或15所示的核苷酸序列；该核酸分子可操作地连接至启动子；本专利技术公开了一种表达载体，该表达载体含有所述的核酸分子；本专利技术公开了一种质粒，所述的质粒是一种病毒质粒。本专利技术公开了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述的表达载体，或其基因组中整合上述的核酸分子。本专利技术中，所述的抗PD-1单克隆抗体、CDR区以及FR区是全人源的。本专利技术中，优选的单克隆抗体为IgG1。本专利技术中，优选的抗原结合片段是scFv,Fv,Fab或F(ab)2。本专利技术公开了一种双特异性抗体，该双特异性抗体含有上述的单克隆抗体或抗原结合片段。本专利技术公开了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有上述的单克隆抗体或抗原结合片段，或所述的双特异性抗体，与一种效应分子偶联；所述的偶联分子是可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。本专利技术公开了一种CAR-T细胞，该细胞表面展示有上述的单克隆抗体或抗原结合片段。进一步，本专利技术提供了所述的抗PD-1全人源单克隆抗体或抗原结合片段的用于制备检测生物样品中的PD-1或用于制备治疗肿瘤的药物用途。在本专利技术的一些实施方式中，单克隆抗体，或抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列和/或重链可变区的氨基酸序列，包含至少一个P2-G12的轻链和/或重链可变区的互补决定区(CDR)；利用此抗体CDR区或部分或全基因，可在原核和真核细胞及任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体，进一步用于临床上诊断或治疗肿瘤。本专利技术提供了针对人PD1的全人源单克隆抗体、其抗原结合片段的氨基酸序列以及编码这些蛋白的核苷酸序列，相应的表达载体和能表达该抗体的宿主细胞，以及抗体Fab和IgG1形式的生产方法，所述抗体是在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合PD1的抗体，利用此抗体CDR区或部分或全基因，可在原核和真核细胞及任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体，进一步用于制备预防或治疗多种类型的恶性肿瘤的药物。附图说明图1.针对人PD-1蛋白特异性抗体筛选富集，其中，用生物素标记的PD-1(ECD)-hFc对抗体库进行4轮噬菌体筛选，多克隆噬菌体ELISA检测特异性抗体的富集，从第二轮筛选后抗体开始逐渐富集，至第四轮抗体富集最显著，表明抗PD-1的抗体得到了富集。图2.由大肠杆菌表达的Fab形式的PD-1抗体进行表达和经镍柱亲和层析纯化后，用SDS-PAGE检测其纯度。图3.ELISA检测特异性抗体P2-G12的Fab或IgG1形式与PD-1的结合亲和力。图4.FACS检测P2-G12与过表达人全长PD-1蛋白的HEK293T细胞的结合能力。具体实施方式实施例1针对人PD-1蛋白特异性单域抗体的富集筛选筛选方法依照所报道的文献所述，利用之前构建的库容量为1.5×1011的超大型噬菌体展示的全人源Fab抗体库，针对生物素标记的PD-1(ECD)-hFc融合蛋白来筛选抗体。将生物素标记的PD-1(ECD)-hFc融合蛋白固定在链亲和素包被的磁珠上，1012个噬菌体展示的抗体在常温下于1,2,3,4轮分别与5,4,2,1微克抗原孵育两小时，每轮的筛选所用的噬菌体均为1012个实施例2多克隆噬菌体-酶联免疫分析检测经过多轮筛选后，对每轮筛选后得本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种针对人PD1抗原的全人源单克隆抗体或抗原结合片段的重链和轻链的互补决定区CDR，其特征在于，所述的抗体的CDR区主要包含：/n抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:3的CDR1，SEQ ID NO:4的CDR2，及SEQ ID NO:5的CDR3；抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:6的CDR1，SEQ ID NO:7的CDR2，及SEQ ID NO:8的CDR3。/n
【技术特征摘要】
1.一种针对人PD1抗原的全人源单克隆抗体或抗原结合片段的重链和轻链的互补决定区CDR，其特征在于，所述的抗体的CDR区主要包含：
抗体的轻链可变区含有SEQIDNO:3的CDR1，SEQIDNO:4的CDR2，及SEQIDNO:5的CDR3；抗体的重链可变区含有SEQIDNO:6的CDR1，SEQIDNO:7的CDR2，及SEQIDNO:8的CDR3。
2.如权利要求1所述的一种针对人PD1抗原的全人源单克隆抗体或抗原结合片段的重链和轻链的互补决定区CDR，其特征在于，所述的抗体或抗原结合片段包括框架区FR和权利要求1要求的互补决定区CDR，所述的FR区主要包含：
抗体的轻链框架区由SEQIDNO:1的1-23位，30-46位，50-85位，和/或96-105位氨基酸，及抗体的重链框架区由SEQIDNO:2的1-25位，34-50位，59-96位，和/或115-125位氨基酸。
3.如权利要求1所述的一种针对人PD1抗原的全人源单克隆抗体或抗原结合片段的重链和轻链的互补决定区CDR，其特征在于，所述的针对人PD1抗原的全人源单克隆抗体或抗原结合片段，是针对人PD-1表位的抗体，并且具有如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的CDR区，权利要求2所述的FR区，和/或权利要求3所述的抗PD-1单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，具有如SEQIDNO:9或15所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的核酸分子，可操作地连接至启动子。
7.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求4...
【专利技术属性】
技术研发人员：应天雷，吴艳玲，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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