一种多聚磷酸激酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:1，该突变体较野生型序列SEQ ID NO:3对ATP再生能力有明显的提升，采用该多聚磷酸激酶突变体作为ATP再生剂，可促进谷胱甘肽合成酶催化法生产谷胱甘肽。

A polyphosphate kinase mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
一种多聚磷酸激酶突变体及其应用
本专利技术属于基因工程和酶催化
，具体地说，涉及一种多聚磷酸激酶突变体，及其以多聚偏磷酸为底物将ADP转化ATP的用途。
技术介绍
ATP(Adenosinetriphosphate，简称三磷酸腺苷)是一种高能磷酸化合物，参与细胞内众多酶催化、蛋白代谢、生物合成过程，并提供能量。工业上ATP也参与了许多重要的生物活性物质及化学药物的生物合成，但因ATP原料成本价格高的因素，限制了ATP参与的酶促反应的工业化应用，因此ATP合成以及ATP的循环再生利用成为该方向主要需要解决的问题。目前ATP再生技术的文献报道主要有三种：以高能磷酸化合物和ADP为底物，经磷酸转移酶催化使ADP磷酸化生成ATP；以酵母细胞为宿主，加入葡萄糖使其糖酵解生成ATP；ADP和无机磷在光照条件下转化成ATP，其中前两种方式的应用报道较多。采用酵母全细胞催化再生循环合成ATP是较早进入工业化的方式，但该方向需要加入大量的ATP再生旺盛的酵母活细胞在反应体系中，酶促反应体系复杂，副产物较多，且工业化成本相对较高。采用高能磷酸化合物作为底物催化ADP生产ATP是现在这个方向中研究的重点，其中乙酸激酶和多聚磷酸激酶是常用的ATP再生用酶。乙酸激酶以乙酰磷酸作为高能磷酸化合物底物参与ATP合成，其中最常用的是乙酰磷酸盐为乙酰磷酸锂盐，乙酸激酶的催化效率较高，但其使用的底物乙酰磷酸盐热稳定性差，非常易于分解，底物实际利用率低，且酶催化反应体系中的副产物较多，控制工艺复杂，产品成本较高，因此很难放大生产。多聚磷酸激酶采用多聚偏磷酸作为底物参与ATP再生合成反应，该酶所用的底物廉价且稳定，操作过程简便，易于放大。1988年，MurataKousaku等研究了D-丙氨酰-D-氨基酸连接酶与蓝细菌中的聚磷酸激酶联用，合成D-丙氨酸二肽，成功地进行了两个反应的偶联，D-丙氨酸二肽的产率高达80％。2016年北京化工大学刘珞老师课题组，采用多聚磷酸激酶(PPK)介导的ATP再生系统与谷胱甘肽双功能合成酶(GS)偶联，共同作用催化，初始仅加入体系需求量20％的ATP情况下，浓度约20mM，产物转化率83.8％，产量高达13g/L。但该酶的催化效率普遍偏低，酶活容易受多聚磷酸盐的抑制，体系中ATP加量较大，产品的生产成本依然很高，因此工业化推广没有优势。因此开发一种高性能的多聚磷酸激酶突变体，用于ATP再生系统，将极大的促进ATP再生相关产品的技术革新。
技术实现思路
为了克服目前多聚磷酸激酶酶活低，底物耐受性差即底物抑制性高的缺陷，本专利技术利用基因工程技术来对谷氨酸棒杆菌CorynebacteriumglutamicumATCC13032来源的多聚磷酸激酶(PPK2)进行改造和筛选，构建以六聚偏磷酸钠为底物的高性能多聚磷酸激酶突变体，从而有利于实现以多聚偏磷酸为底物的ATP再生系统的工业化应用。为此，本专利技术通过随机突变、组合突变等技术对CorynebacteriumglutamicumATCC13032来源的多聚磷酸激酶(SEQIDNO:3)进行改造，获得以六聚偏磷酸钠作为底物的高酶活的多聚磷酸激酶突变体SEQIDNO:1，以便高效地催化六聚偏磷酸钠上的高能磷酸键转移至ADP上，产生ATP。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:1：MVGKLPIMAETNENDLPVIDLAQIEGYVVDDSDEGDPVLLRPDGTPIETWREDFPYEERVTREDYEKVKRSLQIELLKWQNWTKETGQRHIILFEGRDAAGKGGTIKRFNEHLNPRGARTVALEKPSPRESTSWYFQRYIQHFTAAGEIVFFDRSWYNRSGVERVLGFCTESQHAEFLREVPMLENMILGSGISLTKFWFSVTRKEQRTRFAIRQVDPVRQWKLSPMDLASLDRWDDYTRAKEEQFRYTDTDESPWITIKSNDKKRARINAMRYVLSKFDYTDKDYELVGEPDPKVVLRGRDQIGD(SEQIDNO:1)。其为野生型多聚磷酸激酶(PPK2)的氨基酸序列SEQIDNO:3第35位的D替换为G、第144位的P替换为T、第166位的M替换为L的突变体。本专利技术的第二个方面提供了编码上述多聚磷酸激酶突变体基因。优选地，编码上述多聚磷酸激酶突变体SEQIDNO:1的基因可以是下述核苷酸序列：ATGGTTGGTAAACTGCCGATCATGGCTGAAACCAACGAAAACGACCTGCCGGTTATCGACCTGGCTCAGATCGAAGGTTACGTTGTTGACGACTCTGACGAAGGCGACCCGGTTCTGCTGCGTCCGGACGGTACCCCGATCGAAACCTGGCGTGAAGACTTCCCGTACGAAGAACGTGTTACCCGTGAAGACTACGAAAAAGTTAAACGTTCTCTGCAGATCGAACTGCTGAAATGGCAGAACTGGACCAAAGAAACCGGTCAGCGTCACATCATCCTGTTCGAAGGTCGTGACGCTGCTGGTAAAGGTGGTACCATCAAACGTTTCAACGAACACCTGAACCCGCGTGGTGCTCGTACCGTTGCTCTGGAAAAACCGTCTCCGCGTGAATCTACCTCTTGGTACTTCCAGCGTTACATCCAGCACTTCACGGCTGCTGGTGAAATCGTTTTCTTCGACCGTTCTTGGTACAACCGTTCTGGTGTTGAACGTGTTCTGGGTTTCTGCACCGAATCTCAGCACGCTGAATTCCTGCGTGAAGTTCCGATGCTGGAAAACATGATCCTGGGTTCTGGTATCTCTCTGACCAAATTCTGGTTCTCTGTTACCCGTAAAGAACAGCGTACCCGTTTCGCTATCCGTCAGGTTGACCCGGTTCGTCAGTGGAAACTGTCTCCGATGGACCTGGCTTCTCTGGACCGTTGGGACGACTACACCCGTGCTAAAGAAGAACAGTTCCGTTACACCGACACCGACGAATCTCCGTGGATCACCATCAAATCTAACGACAAAAAACGTGCTCGTATCAACGCTATGCGTTACGTTCTGTCTAAATTCGACTACACCGACAAAGACTACGAACTGGTTGGTGAACCGGACCCGAAAGTTGTTCTGCGTGGTCGTGACCAGATCGGTGACTAA(SEQIDNO:2)。本专利技术的第三个方面提供了包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET24a，但并不受限于此。本专利技术的第四个方面提供了转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述多聚磷酸激酶突变体。优选地，上述微生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。/n

【技术特征摘要】
1.一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:1。


2.编码如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的基因。


3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQIDNO:2。


4.包含如权利要求3所述基因的质粒。


5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。


6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，是所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌。


7.如权利要求6所述的微生物，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，王金刚，梁岩，高书良，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33