高活性果糖缬氨酸氧化酶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种高活性果糖缬氨酸氧化酶及其制备方法，其氨基酸序列为ＳＥＱ　ＩＤ．Ｎｏ．２的序列；核苷酸序列为ＳＥＱ　ＩＤ．Ｎｏ．１所示序列。制备步骤为：（１）以Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．２－４－１的ＦＶＯ基因编码序列为模板，进行易错ＰＣＲ扩增，建立果糖缬氨酸氧化酶的突变文库；（２）将突变文库转入大肠杆菌，对其基因进行克隆、重组转化和表达；（３）利用醌法测定酶活性，筛选出高活性果糖缬氨酸氧化酶。所得果糖缬氨酸氧化酶活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性的６倍，其可用于糖化Ｈｂ试剂盒检测，所用酶量减少，反应时间缩短。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高活性果糖缬氨酸氧化酶，本专利技术也同时涉及一种高活性果糖缬 氨酸氧化酶的制备方法。
技术介绍
血液中的糖化血红蛋白(以下简称糖化Hb)反映了一段时期内生物体内的血 糖水平，近年来被用作糖尿病的诊断和治疗的重要指标。目前，糖化Hb可采用高效 液相色谱法、微柱法、免疫法、色素法等方法来测定，但这些方法或者需要专用仪器、 价格昂贵，或者检测时间长、测量精度差，最近流行的酶法检测，利用氧化还原反应， 不需要特殊的测定仪器，操作简便易行，精度高，时间短，因此广泛应用于生化分析 和临床检査。利用上述氧化还原反应的糖化Hb的测定过程中，需要一类特殊的酶类——果糖 基氨基酸氧化酶，该酶可作用于糖化Hb或糖化氨基酸，产生过氧化氢，然后添加过 氧化物酶和还原剂，使过氧化氢和还原剂之间发生氧化还原反应，可通过测定还原剂 的显色来测定过氧化氢量，从而可知样品中糖化Hb含量。然而，利用现有果糖基氨基酸氧化酶催化该反应，时间仍嫌稍长，酶量需求较高。 所以要求开发新型高活性果糖基氨基酸氧化酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述不足，提供一种活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性 6倍的高活性果糖缬氨酸氧化酶，其可用于糖化Hb试剂盒检测，所用酶量减少，反 应时间縮短。本专利技术的另一目的在于提供一种高活性果糖缬氨酸氧化酶的制备方法。 本专利技术基于果糖缬氨酸氧化酶的编码序列，通过易错PCR技术，建立了果糖缬 氨酸氧化酶的突变文库，将突变文库转入大肠杆菌，进行两轮筛选，得到了活性约为 普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍的新型高活性果糖缬氨酸氧化酶。该高活性果糖纈氨 酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQID.No.2的序列。本专利技术的一种编码高活性果糖缬氨酸氧化酶的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID. No. 1所示序列。本专利技术的高活性果糖缬氨酸氧化酶的制备方法步骤如下(1) 以Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR 扩增，建立果糖缬氨酸氧化酶的突变文库；(2) 将突变文库转入大肠杆菌，对'其基因进行克隆、重组转化和表达；(3) 利用醌法测定酶活性，筛选出高活性果糖缬氨酸氧化酶。 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性 差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能。为此，人们利用酶的定 向进化技术对天然酶进行改造，从而获得预先期望的具有某些特性的进化酶。定向进化包括随机突变和筛选，其中随机突变应用较为普遍的技术是易错PCR 突变，即通过调整PCR体系中的离子浓度，各种dNTP含量，引物和模板浓度，使用 易产生突变的Taq酶，使用突变率高的菌株等方法，使PCR产物相对于模板产生许 多点突变，从而改变蛋白的氨基酸序列。*通过条件筛选，获得具有期望特性的目的酶。棒状杆菌属Corynebacterium sp. 2-4-1菌株含有果糖基缬氨酸氧化酶(FVO)的编 码基因。本专利技术基于FVO的基因编码序列，设计两条FVO基因的易错PCR引物， 上游引物序列为5，-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3，，下游引物序列 为5'-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3，。以FVO的基因编码序列作 为模板，进行易错PCR扩增，经扩增35个循环后，PCR产物纯化回收，与原核表达 载体pMD-l8 T Vector连接，转化入大肠杆菌XLl-Red中，涂布LB平板，收集含有 插入片段的克隆，组成突变体库。提取突变体库中的质粒DNA，酶切，回收目的片段，连接入载体pGEX-4T-lm，转 化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果.糖缬氨酸和N-(羧甲基氨基羰基)-4,4-二(甲 基氨基)-联苯胺的LB平板，由于大肠杆菌自身含有过氧化物酶，故37'C培养 12-24小时后，可见明显变色现象。挑取变g快和变色圈大的克隆进行液体培养基培 养。将初步筛选出的克隆在25'C液体培养基中培养48小时，诱导表达，裂解细菌， 利用醌法测定酶活性，最终得到一株酶活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍的高活性菌株，其所携带的FVO突变命名为FV0-m-21。通过测序分析发现，该突变克隆中 发生五个碱基点突变，分别是碱基序列中57位C—T、 374位T—C、 534位G—A、 914 位C—A和1056位G—C，共引起了两个氨基酸突变，分别是氨基酸序列中125位Ile —Thr和305位Ala—Glu。将FVO-m-21大量培养，诱导表达后纯化分离目的酶，用 于糖化Hb蛋白的检测，可得到较好效果。本专利技术的果糖缬氨酸氧化酶，活性高，约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍，其 可用于糖化Hb试剂盒检测，所用酶量减少，反应时间縮短，适合于试剂盒的制备和 应用，可广泛应用于临床检测。而且，制备方法都是采用现有常规手段，易于实施。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术，但并不仅限于下述实施例。 实施例1以Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR扩增。1. 引物序列正向弓I物 5 ，-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3' 反向引物 5'陽TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3 ，2. 易错PCR反应体系和反应条件PCR反应体系 100nL体系中含有10 mM Tris-HClpH 8.30， 50 mM KC1， 6.5 mM MgCl2， 0.15 mM MnCl2， 0,2 mM dGTP/dATP， 0.8 mM dTTP/dCTP， 2.2 pg SSB Protein, 0.5正向/反向引物，10 ng模板DNA 2.5单位TaqDNA聚合酶。 PCR反应条件94 。C 5 min; 94 °C 30 see, 55 。C 30 sec， 72 °C 2 min, 35个循环；72 °C 10 min; 4 。C forever 。3. 易错PCR产物取3 nL于P/。的琼脂糖凝胶电泳，可见l kb左右有产物条带。将 易错PCR产物用纯化回收试剂盒纯化回收，与pMD-18TVector连接，转化入大肠杆 菌XL 1-Red中，涂布Amp抗性LB平板，可获得Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基 因的突变体库。 实施例2:突变体菌株的初筛提取突变体库中的质粒DNA，用BamHI和Hind III双酶切，回收lkb左右的目 的片段，载体pGEX-4T-lm同样用BamH I和Hind III双酶切，回收，二者4'C连接过 夜，转化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖缬氨酸和1^-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺的LB平板；37'C培养12-24小时后，可见明显变色现 象。挑取变色快和变色圈大的克隆进行液体培养基培养，共挑取克隆48个。实施例3:突变体酶活性的醌法检测1. 在诱导表达4小时后，收集菌液，测量并且记录细胞培养物的OD600值。2. 制备检测酶活的细菌裂解液。在374hLB-PERtm细菌蛋白抽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高活性果糖缬氨酸氧化酶，其特征在于其氨基酸序列为ＳＥＱ　ＩＤ．Ｎｏ．２的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邹炳德，姜云飞，
申请(专利权)人：宁波美康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：97[中国|宁波]