一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤：（１）获取原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞，（２）获取传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞；所述步骤（１）具体为：取得的大鼠远端肺静脉血管中膜用消化液在３５～３７℃消化２０～２５ｍｉｎ后提取远端肺静脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。该培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞纯度高、形态均一、生长良好、且具有典型的平滑肌细胞的形态及特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞培养方法，尤其是一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方 法，属生物

技术介绍
肺静脉平滑肌细胞，尤其是远端肺静脉平滑肌细胞，是研究肺循环相关疾病、尤其 是肺动脉高压及肺静脉高压等疾病发病机制的重要细胞材料。大鼠作为目前生命科学研 究领域最常见、最实用、最方便的实验动物，其肺动脉平滑肌细胞的培养方法己经较为 成熟。但是关于以大鼠远端肺静脉为平滑肌细胞来源的细胞培养方法却无报道，分析原 因主要由于1、大鼠体形较小，心肺组织更小，用常规分离牛、猪等大型动物远端肺 动脉的方法来分离大鼠的远端肺静脉难度太大、不易成功；2.分离到的大鼠远端肺静脉 较肺动脉弹性差，且外膜、中膜及内膜无明显过度分界，尤其中膜平滑肌层较肺动脉薄。 由于目前尚无肺静脉平滑肌细胞方面的研究报道，制约了对于肺动脉高压及肺静脉高压 发病机制的研究。因此，寻找一种高效、简便、纯度高、成本低的大鼠远端肺静脉平滑 肌细胞原代培养的方法成为了关键的一步。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。该培养方法技术 稳定，重复性好，培养的细胞纯度高、形态均一、生长良好、且具有典型的平滑肌细胞 的形态及^^点。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的 一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培 养方法，它包括以下步骤(1) 获取原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞，(2) 获取传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞，其特征是所述歩骤(l)具体为取得的大鼠远端肺静脉血管中膜用消化液在35 37'C消化20 25min后提取远端肺静脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培 养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。 所述步骤(2)具体步骤为当原代细胞达到90%融合密度后，用PBS溶液清洗，加入0. 1 0. 25%胰蛋白酶溶液35 37'C消化2 3分钟，当细胞出现回縮、细胞间隙增大 时，吸除胰蛋白酶溶液，清洗细胞，加入混合培养液，使之形成细胞悬浮液，接种于新 的培养瓶中进行培养，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠远端肺静脉平滑 肌细胞。所述的歩骤(2)的胰蛋白酶溶液的用量为0.3 0.5ml，胰蛋白酶溶液中含0.02% EDTA(乙二胺四乙酸)；所述的细胞接种密度为1 2X105个/ml。所述步骤(1)获取原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的具体步骤为1〉从远端肺静脉组织中取出中膜平滑肌层组织，将其放入含氯化钙的朋SS平衡盐 溶液中4"C静置20 30min，然后放入HBSS平衡溶液中室温静置10 20min;再用消化 液在35 37。C消化中膜组织20 25min，可见组织块松软、边缘发毛；2>吸出消化液，加入混合培养液，室温放置3 5min，经吹打至液体中出现有絮状 物，静置收集细胞悬浮液；重复两次上述步骤；3〉将收集得到的细胞悬浮液离心，弃上清液，加入混合培养也调整细胞密度1 2 X105细胞/ml的密度种植于培养板，置于37"C、 5%0)2培养箱内静置培养，5 6天后 换培养液，当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端 肺静脉平滑肌细胞。本专利技术所采用的混合培养液为含90 105U/ml的青霉素、90 105U/ml的链霉素和 10 20%胎牛血清的低糖DMEM(Dulbcco's Modifed Eagle Medium)培养液。本专利技术所采用的HBSS平衡盐溶液为1000ml三蒸水中加入7.6g氯化钠、0. 38g氯 化钾、0.25g氯化镁、1. 8g葡萄糖和2. 24gHEPES (羟乙基哌嗪乙硫磺酸)配制而成。本专利技术所采用的含氯化钙的HBSS平衡盐溶液为上述HBSS平衡盐溶液每100ml中加 入150ul的1M氯化钙构成。本专利技术所采用的消化液为5mlHBSS平衡盐溶液中加入30. 5 31. 5mg I型胶原酶、1. 5 2. 5mg木瓜酶、9. 5 10. 5mg牛血清白蛋白和0. 65 0. 75mg 二硫苏糖醇配制而成。本专利技术方法与现有技术相比具有以下有益效果-1、培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞纯度高，形态均一，生长良好。2、 将肺静脉平滑肌层的消化时间控制在20 25min，可得到纯度为99%以上的平 滑肌细胞。3、 肺静脉平滑肌细胞的取材部位位于远端肺静脉，经本专利技术提供的方法获得的细 胞经过显微镜观察及细胞免疫荧光鉴定具有典型的平滑肌细胞形态及特点，为进一步深 入研究肺循环相关疾病、小血管相关疾病，尤其是肺动脉高压及肺静脉高压等疾病的发 病机制奠定了条件，提供了丰富的实验材料来源。附图说明图1是荧光显微镜(200X)下远端肺静脉平滑肌细胞浆平滑肌a-Actin抗原发红色 阳性荧光反应；图2是荧光显微镜(200X)下远端肺静脉平滑肌细胞核胞浆中出现绿色的阳性荧光 反应；图3是荧光显微镜(200X)下远端肺静脉平滑肌细胞核胞浆中的肌丝平行于细胞长 轴呈细丝状表达；图4是荧光显微镜(200X)下阴性对照无加一抗的远端肺静脉平滑肌细胞核胞浆中 出现绿色的阳性荧光反应；图5是荧光显微镜(100 X)下远端肺静脉平滑肌细胞；图6是荧光显微镜(100X)下远端肺静脉平滑肌细胞核胞浆中出现绿色的阳性荧光 反应；图7是荧光显微镜(200X)下远端肺静脉平滑肌细胞浆平滑肌a -Actin抗原发红色 阳性荧光反应。具体实施例方式下面结合实例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于 此，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术 上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。 实施例一-具体步骤-1、主要实验材料(1) 、动物来源大鼠可用6 8周龄(250 300g)的雄性SD大鼠。(2) 、 HBSS平衡盐溶液:1000ml三蒸水中加入7.6g氯化钠、0.38g氯化钾、0. 25g 氯化镁、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES，实验前24小时配制并过滤除菌。(3) 、消化液5mlHBSS平衡盐溶液中加入31mg I型胶原酶、2mg木瓜酶、10mg 牛血清白蛋白和0. 7mg 二硫苏糖醇配制而成。(4) 、混合培养液为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和10%胎牛血清的 低糖DMEM培养液。(5) 、 1. 5mM氯化钙的HBSS平衡盐溶液100ml的冊SS平衡盐溶液加入150u 1 的1M氯化f丐2、操作步骤(1)、获取大鼠远端肺静脉1) 称重大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(150mg/kg)麻醉大鼠，无菌条件下取大鼠心 肺组织，用HBSS平衡盐溶液洗除血污；2) 将心肺组织置于外科显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜下小心分离远端 肺静脉；3) 将血管放入冷的HBSS中以洗去血污，调大显微镜的放大倍数，于显微镜观察下 用显微镊和显微剪刀小心剥离血管外膜；4) 将剥离外膜的血管条纵向剪开，用玻璃棒自上而下刮除内膜，留中膜平滑肌层;5) 将中膜组织放入1.5mM含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中4。C30min， HBSS平衡盐溶 液中室温20min;6) 再将组织块放入离心管中加入消化液37。C消化20 25min，晃动离心管可见组织 块松软、边缘发毛；7) 轻轻吸出消化液，加入混合培养基5ml，室温放置3min，广口巴氏吸管吹打数本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤：　（１）获取原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞；　（２）获取传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞，　其特征是，所述步骤（１）具体为：取得的大鼠远端肺静脉血管中膜用消化液在３５～３７℃消化２０～２５ｍｉｎ后提取远端肺静脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王健，冉丕鑫，李晓岩，李冰，彭公永，胡锦兴，卢文菊，洪城，赖宁，
申请(专利权)人：广州医学院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]