一种双果糖酐Ⅲ的双酶耦合制备方法技术

一种双果糖酐ＩＩＩ的双酶耦合制备方法，属于功能性食品生物加工技术领域。本发明专利技术以蔗糖为底液，采用蔗糖果糖转移酶和菊糖果糖转移酶，通过双酶耦合催化反应来合成双果糖酐ＩＩＩ。蔗糖底物浓度控制在２０～３００ｇ／Ｌ，先用蔗糖果糖转移酶反应，添加量为１～２０Ｕ／ｇ底物，在３０～５５℃催化反应４～１２小时，再加入菊糖果糖转移酶，添加量为２～１５Ｕ／ｇ底物，在４０～６０℃催化反应１２～３６小时，生物转化率超过３５％。本发明专利技术生产方法简单，对环境无污染，所得到的双果糖酐ＩＩＩ安全可靠，属于一种市场前景广阔的低热量新型甜味剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种双果糖酐III生物制备方法，尤其是指一种双果糖酐III的双酶 耦合制备方法，属于功能性食品生物加工

技术介绍
近年来，功能食品成为广大消费者关注的热点，其开发更是广大食品从业者研发 的焦点。糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低龄化，使得低热量、具有更多功能 营养特性的功能性甜味剂成为关注的热点。双果糖酐III(Difruc0Se anhydride，DFAIII)是一种两个果糖结合的最小的非 还原性双糖，菊苣、菊芋等植物中含有少量的双果糖酐III，在蜂蜜、咖啡等的加工过程中产 生少量双果糖酐III。其相对甜度为蔗糖的一半，而热量值却只有蔗糖的1/15 ；性质十分 稳定，74%相对湿度下不吸湿；对热和酸十分稳定，在高酸度与高温的条件下不会水解，在 一般食品加工条件下，几乎不会出现褐变或分解现象。双果糖酐III还具有良好的生理功 能，如在消化道不吸收，且不产生能量，可作为一种甜味剂；作为一种增歧因子，可促进肠道 微生物的生长，明显改善排便、利尿功能；作为促进人体对Ca、Mg、Zn、CU等矿物元素吸收的 功能性糖类，增进骨骼的生长；不能被诱发蛀牙的口腔链球菌利用，不产酸，具有抗龋齿的 功能。这些优点使其在食品工业中的应用有广阔的前景。天然的双果糖酐III含量很少，提取分离成本高，化学合成有许多不利的因素， 比如分离纯化复杂且污染环境；而生物法制备双果糖酐III，属于天然产品，符合消费者 的心理，因此采用生物转化法成为双果糖酐III制备研究的热点。生物转化法的研究有 30多年的历史，1973年Uchiyama T首次从产脲节杆菌中发现了菊糖果糖转移酶(inulin fructotransferase, EC2. 4. 1.93)，迄今为止，已发现十余种微生物可以产此酶，主要集中 在节杆菌属，包括 Arthrobacter urefaciens7116、Arthrobacter sp. A_6、Arthrobacter ilicis 0K17B、Arthrobacter globiformisCl1-1、Arthrobacter sp. H65-7、Arthrobacter pascens T13-2、Arthrobacter sp. Buol41、 Arthrobacter sp. L68-1,另外在三种其它 菌属中也发现 了此醇，如 Flavobacterium sp. LC—413、Bacillus sp. Snu_7、Leifsonia sp.T88-4。本专利技术人深入调查和研究了现有技术并对各种产双果糖酐III的方法进行了研 究，提出以一种新的底物蔗糖和两种酶(蔗糖果糖转移酶与菊糖果糖转移酶)结合作用制 取双果糖酐III的方法。通过蔗糖果糖转移酶将蔗糖转化为低聚果糖，再加入菊糖果糖转 移酶，得到双果糖酐III。基于上述发现提出了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种廉价的双果糖酐III的双酶耦合制备方法。利用双酶耦 合的方法，区别现有大多数单酶的生产方法。本专利技术的技术方案一种双果糖酐III的双酶耦合制备方法，其步骤为A、将蔗糖作为底物溶于去离子水中，配成蔗糖反应底物，蔗糖反应底物浓度控制 在20 300g/L，调节pH值5 7，升温至30 55°C，加入蔗糖果糖转移酶，加入量为1 20U/g蔗糖，恒温反应4 12小时；B、在步骤(A)之后，再加入菊糖果糖转移酶，加入量为2 15U/g蔗糖，调节pH值 5 7，利用双酶耦合催化反应技术，40 60°C保温反应12 36小时，转化率达35%以上；C、将步骤(B)所得转化产物溶液加热，灭酶活，加入所得体系质量分数 3% 的活性炭，脱色过滤；浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中加入浓缩液2 5倍体积的乙 醇，冷却结晶；离心去除上清液后，用乙醇清洗晶体表面残留液，干燥后得到双果糖酐III 粗品；D、重结晶将得到的双果糖酐III粗品按质量分数10% 30%的浓度溶解于去离 子水中，升温至70 80°C，加入双果糖酐III粗品质量分数3%的活性炭，脱色过滤，浓缩 至有少量晶体析出后，向浓缩液中加入浓缩液2 5倍体积的乙醇，冷却结晶，离心去除上 清液后，用乙醇清洗晶体表面残留液，干燥后得到双果糖酐III成品。根据本方法转化效率及后续提取、加工等工艺的要求，有效地控制酶在转化液中 的浓度，不仅可以提高转化率，也可充分利用酶活力，是反应体系达到最佳的稳定条件，确 保产品的加工工艺要求。上述双果糖酐III的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤A中，转化液底物 浓度控制在20 300g/L。底物浓度的控制决定反应底物的转化率，符合后续加工工艺的要 求，因此有效地控制反应底物的浓度，不仅可以提高反应转化率，也可充分地利用酶活力， 使反应条件符合反应动力学的要求，从而达到稳定工艺，提高生产效率，节约能源。上述双果糖酐III的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤B中，溶液中加入 菊糖果糖转移酶的量是2 15U/g(酶活力/底物质量)。上述双果糖酐III的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤C和D为精制过 程。生产过程中，一次性产品出来很难直接达到合格，因此需要一个精制过程。用高效液相色谱法检测DFAIII的含量。HPLC检测条件糖柱(Waters Sugur-Pak 1,6. 5X300mm)；流动相超纯水；示差折光检测器(Shodex RI101)；柱温80°C ；流速 0. 4mL/min ；进样量10ii L。检测反应液的DFAIII的峰面积与一定浓度的标准样品DFAIII的峰面积的比值， 得出反应液中DFAIII的含量。本专利技术的有益效果本专利技术方法的转化率可超过35%。本专利技术利用微生物产酶，酶活力高，容易得到酶液。产酶的微生物均来源于自然， 稳定性高，安全性好；本专利技术特点在于工艺控制稳定，生产成本低，能耗低，所得产品安全可靠等优点， 具有产业化的前景。附图说明图1高效液相色谱法检测DFAIII的含量图具体实施例方式实施例1 将100g蔗糖干品溶解于1L去离子水中，用lmol/L盐酸调节pH至5. 5，升温至 30°C，加入蔗糖果糖转移酶对底物的量是lU/g，恒温转化12小时；再加入菊糖果糖转移酶 对底物的量是15U/g，温度40°C、pH5. 5，反应36小时，转化率可达37%。灭酶活，加活性炭 脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中加入浓缩液体积2倍的乙醇，冷却结晶。 离心去除上清液后，用乙醇清洗晶体表面残留液，干燥后得到DFAIII粗品。将得到的DFAIII粗品取100g按质量分数10%的浓度溶解于去离子水中，升温至 70°C，加入粗品质量分数3%的活性炭，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中加 入浓缩液2倍体积的乙醇，冷却结晶，离心去除上清液后，用乙醇清洗晶体表面残留液，干 燥后得到DFAIII成品。用高效液相色谱法检测DFAIII的含量，含量见图1。HPLC检测条件糖柱(Waters Sugur-Pak 1,6. 5X 300mm)；流动相，超纯水；示差折光检测器(ShodexRIlOl)；柱温， 80°C ；流速，0. 4mL/min ；进样量，10 u L。检测反应液的DFAIII的峰面积与一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
一种双果糖酐III的双酶耦合制备方法，其特征在于步骤为A、将蔗糖作为底物溶于去离子水中，配成蔗糖反应底物，蔗糖反应底物浓度控制在20～300g/L，调节pH值5～7，升温至30～55℃，加入蔗糖果糖转移酶，加入量为1～20U/g蔗糖，恒温反应4～12小时；B、在步骤(A)之后，再加入菊糖果糖转移酶，加入量为2～15U/g蔗糖，调节pH值5～7，利用双酶耦合催化反应技术，40～60℃保温反应12～36小时，转化率达35％以上；C、将步骤(B)所得转化产物溶液加热，灭酶活，加入所得体系质量分数1％～3％的活性炭，脱色过滤；浓缩至有少量晶体析出后...

【专利技术属性】
技术研发人员：江波，缪铭，杭华，周榴明，张涛，沐万孟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32