蛋白激酶A催化亚基TPK1基因改造方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种真核生物的基因改造方法，通过基因编辑对3’5’‑环腺苷酸依赖的蛋白激酶，即蛋白激酶A催化亚基的TPK1编码基因进行碱基突变，从而将该真核生物的TPK1氨基酸序列中与酿酒酵母TPK1氨基酸序列179号位点相对应的丝氨酸突变为天冬氨酸，即237号位点的丝氨酸突变为天冬氨酸。该改造方法不仅能够增强真核体外生物合成体系起始蛋白质翻译效率，更主要的是能够增加体外生物合成体系针对不同蛋白质合成的可能性。同时，本发明专利技术提供包含利用该基因改造方法进行改造的基因工程细胞，以及包含该基因工程细胞制备的细胞提取物的真核无细胞蛋白质合成体系。

Gene transformation of protein kinase a catalytic subunit tpk1 and its application

【技术实现步骤摘要】
蛋白激酶A催化亚基TPK1基因改造方法及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及通过蛋白激酶A催化亚基的氨基酸点突变，调控无细胞蛋白质合成体系中外源蛋白的合成效率。
技术介绍
大部分蛋白在合成过程中经过蛋白质翻译后修饰，一些不合适的修饰常常与疾病相关。蛋白质磷酸化是一种广泛的翻译后修饰，大约30%的蛋白组可以被磷酸化[1]。蛋白质磷酸化在第二信使传递和酶的级联作用中起到关键作用，很多最基础的生物过程如信号传导、基因表达和细胞分裂等都受到蛋白磷酸化的调控，是原核和真核生物中重要的调控修饰形式之一[2]。蛋白质的磷酸化位点在肽链的氨基酸残基上，如酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸等。这些氨基酸残基本身不带电荷，在侧链加入带有强负电荷的磷酸基团后，蛋白质的构型和活性进而发生变化[3]。蛋白质磷酸化是在一系列蛋白激酶的催化作用下完成的。3’5’-环腺苷酸依赖的蛋白激酶(cAMP-dependentproteinkinase)，即蛋白激酶A（proteinkinaseA，PKA)，最早在1968年被识别和纯化，是蛋白激酶家族中重要的一类丝/苏氨酸蛋白激酶[4]。信号分子与质膜上受体结合后，通过G蛋白偶联受体（Gi或Gs）调节腺苷酸环化酶（AC）的活性。AC催化ATP生成cAMP从而控制cAMP的含量，进而决定蛋白激酶PKA的活性。由PKA负责细胞内很多不同类型的蛋白质磷酸化，从而调节生物代谢和基因表达。比如在有营养的状态下，通过Ras-cAMP的信号通路，促进细胞的营养生长。PKA全酶结构是特殊的四聚体，由两个催化亚基（C）和两个调节亚基（R）组成。催化亚基含有水解ATP的活性位点和一个结合调节亚基的结构域。调节亚基含有可以结合cAMP的结构域[5]。在没有cAMP时，催化亚基的活性被调节亚基所抑制，因此四聚体全酶结构下的PKA没有活性。4个cAMP分子可以分别结合两个调节亚基，引起PKA激酶的构象变化，导致两个催化亚基的脱离。在ATP存在时，没有调节亚基结合抑制的催化亚基即可开始磷酸化含有Arg-Arg-X-Ser/Thr序列的丝/苏氨酸蛋白[6]。在酿酒酵母中，PKA激酶的调节亚基是BCY1基因所编码，催化亚基是由三个功能上部分重复的基因所编码，分别为TPK1,TPK2,TPK3。在葡萄糖的刺激下，cAMP/PKA通路被激活，TPK1的Ser179位点的自磷酸化增加，从而导致PKA激酶的活性增强。TPK1的自磷酸化机制有效地调控了在葡萄糖存在下的PKA活性[7]。在酵母中，PKA信号通路在对营养物质的反应上对细胞生长有着重要的作用。在细胞被破碎前，被Ser179的自磷酸化激活的PKA促进细胞生长。而将丝氨酸突变为天冬氨酸，处于PKA持续激活状态下的细胞被制备成裂解液以后，可能有效改变蛋白质的体外合成的效率。鉴于此，我们以克鲁维酵母菌作为试验菌株，模拟丝氨酸的自磷酸化作用，从而判断其是否对无细胞蛋白合成体系中的外源蛋白合成效率有影响。参考文献如下：1.Ptaceketal.,Globalanalysisofproteinphosphorylationinyeast.Nature,2005.438:679-684.2.HunterT.Signaling-2000andbeyond.Cell,2000.100:113-127.3.Kimetal.,PredictionofphosphorylationsitesusingSVMs.Bioinformatics,2004.20(17):3179-3184.4.Walshetal.,Anadenosine3’,5’-monophosphate-dependantproteinkinasefromrabbitskeletalmuscle.J.Biol.Chem.,1968.243:3763-3765.5.Bauman&Scott.,Kinase-andphosphatase-anchoringproteins:harnessingthedynamicduo.NatureCellBiology,2002.4(8):E203-6.6.Voetetal.,FundamentalsofBiochemistry.Wiley.2006,Pg492Solarietal.,RegulationofPKAactivitybyanautophosphorylationmechanisminSaccharomycescerevisiae.Biochem.J.,2014.462:567–579。
技术实现思路
为了解决上述问题，通过序列比对查找到克鲁维酵母菌中相应的丝氨酸位点，并对其相应的核苷酸序列进行改造，从而将该位点的丝氨酸改造成天冬氨酸，以提升无细胞蛋白合成体系中的外源蛋白的合成效率。本专利技术第一方面提供一种真核生物的基因改造方法，其通过基因编辑对3’5’-环腺苷酸依赖的蛋白激酶，即蛋白激酶A催化亚基的TPK1编码基因进行碱基突变，从而将该真核生物的TPK1氨基酸序列中与酿酒酵母TPK1氨基酸序列179号位点相对应的丝氨酸突变为天冬氨酸。进一步的，该相对应的位点为237号位点。进一步的，基因编辑技术为现有技术，可以选择CRISPR/Cas9基因编辑技术。本专利技术第二方面提供一种基因工程细胞，该基因工程细胞的基因组中包含利用第一方面的基因改造方法进行的改造。进一步的，所述细胞为真核细胞。进一步的，所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞之一或其任意组合。进一步的，酵母细胞选毕氏酵母、克鲁维酵母属酵母之一或其组合。进一步的，所述克鲁维酵母属酵母选自乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母之一或其任意组合。本专利技术第三方面提供一种真核无细胞蛋白质合成体系，该合成体系至少包括细胞提取物，所述细胞提取物来自于第二方面中任一项基因工程细胞。本专利技术第四方面提供第一方面中所述基因改造方法、第二方面中所述基因工程细胞在提高真核无细胞蛋白质合成体系中外源蛋白表达量中的应用。本专利技术第五方面提供一种提高真核无细胞蛋白合成体系中外源蛋白表达量的方法，该方法包括：步骤1，提供第三方面所述的真核无细胞蛋白合成体系；步骤2，在步骤1的合体体系中加入编码外源蛋白的DNA分子，在一定条件下进行孵育，合成所述的外源蛋白。进一步的，反应温度为20-35℃，优选的为20-30℃，更优选的为25℃。进一步的，反应时间为0.5-20h，优选的为1-18h，更优选的为2-15h，更优选的为3-12h；上述反应时间可根据具体情况人为确定，也可以为3-15h，也可以为3-20h，也可以为具体的时间点，如3h、5h、10h、15h、18h、20h。本专利技术的主要优点和积极效果主要包括:（1）本专利技术首次通过基因改造技术，借助高效的细胞转化平台，对细胞内的TPK1基因进行改造，从而改变翻译系统的蛋白合成效率；（2）本专利技术首次通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真核生物的基因改造方法，其特征在于：通过基因编辑对3’5’-环腺苷酸依赖的蛋白激酶，即蛋白激酶A催化亚基的TPK1编码基因进行碱基突变，从而将该真核生物的TPK1氨基酸序列中与酿酒酵母TPK1氨基酸序列179号位点相对应的丝氨酸突变为天冬氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种真核生物的基因改造方法，其特征在于：通过基因编辑对3’5’-环腺苷酸依赖的蛋白激酶，即蛋白激酶A催化亚基的TPK1编码基因进行碱基突变，从而将该真核生物的TPK1氨基酸序列中与酿酒酵母TPK1氨基酸序列179号位点相对应的丝氨酸突变为天冬氨酸。


2.一种基因工程细胞，其特征在于：所述基因工程细胞的基因组中包含利用权利要求1所述的基因改造方法进行的改造。


3.根据权利要求2所述的基因工程细胞，其特征在于：所述细胞为真核细胞。


4.根据权利要求3所述的基因工程细胞，其特征在于：所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞之一或其任意组合。


5.根据权利要求4所述的基因工程细胞，其特征在于：酵母细胞选自毕氏酵母、克鲁维酵母属酵母之一或其组合。


6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，王静，许乃庆，姜灵轩，赵玉莲，杨旭，占魁，邓蜜妮，范万巧，娄旭，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31