抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13及其应用制造技术

本发明专利技术专利申请公开了中国野生华东葡萄白河‑35‑1钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13及其应用。本申请涉及基因工程领域，尤其是涉及葡萄抗病育种领域。通过基因克隆技术从抗病的中国野生华东葡萄白河‑35‑1植株基因组分离获得了钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13，并将该基因转入到白粉病易感葡萄植株中获得了抗白粉病的转基因葡萄植株，提高了葡萄的抗白粉病能力。

Grape calcium dependent protein kinase gene vpcdpk13 against powdery mildew and its application

【技术实现步骤摘要】
抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13及其应用
本专利技术专利申请属于植物抗逆基因鉴定及基因工程
，尤其是抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因的分离和鉴定，更具体地涉及一个从中国野生华东葡萄白河-35-1分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13及其抗白粉病的应用。
技术介绍
白粉病是严重危害葡萄生产的重要真菌病害，常导致严重减产甚至绝收，造成巨大经济损失。为防控该病，生产上每年需要喷洒农药20-30次，严重影响葡萄产品的食用安全，威胁人体健康，污染生态环境(Gadoury等人，2012)。目前，葡萄育种者越来越强烈地认识到，尽快挖掘利用野生葡萄的抗病基因，积极开展葡萄精准抗病分子育种，是从根本上解决这一问题的重要途径。钙离子是真核生物细胞中重要的第二信使。钙依赖蛋白激酶(CDPKs)是植物中一类特殊的钙信号解码蛋白，可独立完成钙信号的解码和传递。当植物细胞遭受胁迫时，细胞膜上的受体蛋白识别胁迫信号后会迅速激活钙离子通道，质外体空间的钙离子大量内流导致细胞质中钙离子浓度升高。CDPKs羧基端的EF-hand结构域结合钙离子后促使CDPKs发生构象改变，暴露其激酶活性中心，此时，CDPKs可以与底物蛋白相互作用并将其磷酸化，对下游底物蛋白的活性或稳定性进行调控。上述过程将钙信号(细胞质钙离子浓度振荡)转化为磷酸化事件，实现了胁迫信号的传递与处理，因此，CDPKs蛋白在植物生长发育与逆境胁迫响应过程中发挥重要调控作用(Sheen，1996)。钙依赖蛋白激酶(CDPKs)以基因家族形式存在于葡萄基因组中。然而，到目前为止，关于葡萄钙依赖蛋白激酶(CDPKs)的研究很少，更没有关于具有抗白粉病功能的葡萄钙依赖蛋白激酶的报道和研究。这可能是因为抗白粉病的葡萄品种资源匮乏，大多数葡萄品种都是易感白粉病的。例如，葡萄基因组首次测序所采用的欧亚种葡萄品种黑比诺葡萄(PinotNoir)以娇贵而闻名，它为许多世界佳酿(如罗曼尼·康帝)葡萄酒所采用。然而包括该葡萄在内的大多数欧亚种葡萄品种易遭受白粉病等病害的侵害(Amrine等人，2015；Gao等人，2016；Yin等人，2017)。野生华东葡萄(Vitispseudoreticulata)是我国特有的葡萄野生种。西北农林科技大学野生葡萄种质资源圃中保存的华东葡萄株系白河-35-1对葡萄白粉病、霜霉病等主要葡萄病害表现出较高抗性，但其具体的遗传学基础(抗病基因)目前并不清楚(Gao等人，2016；Yin等人，2017)。本文以白粉病易感品种黑比诺葡萄(参考基因组)的钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13为参考，设计特异引物，采用基因克隆技术从华东葡萄株系白河-35-1基因组cDNA文库中克隆获得了分离的抗白粉病的钙依赖蛋白激酶基因，其为葡萄抗白粉病精准分子育种提供基因资源和分子标记具有重要理论价值和实践意义。
技术实现思路
本专利技术专利申请从中国野生华东葡萄白河-35-1分离获得了钙依赖蛋白激酶(CDPKs)基因VpCDPK13，并证明该基因具有抗白粉病功能。本申请还涉及VpCDPK13用于葡萄抗白粉病的用途。在一个实施方案中，本申请的分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本专利技术专利申请的一个方面涉及分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶，其由本申请所述的分离的抗白粉病的钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13编码，所述钙依赖蛋白激酶具有SEQIDNO:13所示的氨基酸序列。本专利技术专利申请的一个方面涉及分离的抗白粉病的钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13在创制抗白粉病转基因葡萄品种的用途。本专利技术专利申请的一个方面涉及一种产生抗白粉病的转基因葡萄植株的方法，其特征在于将本申请所述的分离的葡萄抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13导入到葡萄植株中并稳定表达。因此，本专利技术专利申请的一个方面还涉及一种提高葡萄植株抗白粉病能力的方法，其特征在于将本申请所述的分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13导入到该葡萄植株物中。在本申请的一个实施方案中，本专利技术专利申请提供华东葡萄白河-35-1钙依赖蛋白激酶VpCDPK13的实时荧光定量PCR检测引物以及内参基因VpActin1的引物，引物序列如下：分别检测VpCDPK13基因在华东葡萄白河-35-1的不同叶龄叶片，生物胁迫(白粉菌侵染)、非生物胁迫(盐、低温、高温)、外源激素处理(水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(Eth))后的表达情况。结果表明，VpCDPK13基因在转录水平上受白粉菌、高温、盐及多种激素处理诱导表达并不显著。本专利技术专利申请首次构建了35S::VpCDPK13-GFP植物表达载体，并通过PEG-Ca2+介导的转化法将其导入烟草叶肉细胞原生质体中研究VpCDPK13蛋白的亚细胞定位情况。结果表明，GFP标记的VpCDPK13全长蛋白可同时与mCherry标记的内质网驻留蛋白AtCML5、高尔基体驻留蛋白AtEMP12以及油体蛋白AtCOL3和Atα-DOX1共定位，不能与过氧化物酶体定位导肽PTS1共定位。本专利技术专利申请创制了华东葡萄白河-35-1钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13的过量表达转基因‘无核白’葡萄株系。经PCR检测和WesternBlot检测，确认外源融合蛋白可在转基因葡萄叶片中低水平表达。待转基因葡萄株系和同龄的非转基因葡萄株系移栽至人工气候箱培养箱生长半年后，向其叶片接种强致病力葡萄白粉菌EnNAFU1，在接菌后不同时间点采用台盼蓝染色、二氨基联苯胺染色和苯胺蓝染色等方法检测白粉菌菌丝生长状况以及葡萄的防御响应。统计白粉菌单菌落平均产生的分生孢子数量，测定防御相关植物激素乙烯和水杨酸含量，测定核心防御分子过氧化氢及其清除因子花青素的含量。结果表明，VpCDPK13转基因葡萄株系叶片被白粉菌侵染后相对于野生型葡萄叶片可产生更高水平的乙烯和水杨酸，导致过氧化氢大量积累；同时，促进胼胝质在受侵表皮细胞下方的叶肉细胞中积累，导致过氧化氢向周围表皮细胞扩散并引起花青素在表皮细胞中大量积累，促进了表皮细胞过敏性死亡；从而限制白粉菌菌丝生长和分生孢子的产生，提高葡萄的白粉病抗性。本专利技术专利申请的有益效果：(1)本专利技术专利申请通过克隆技术从华东葡萄白河-35-1获得了分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13。这是迄今为止首次报道的分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因。通过将该基因转入了感病欧洲葡萄品种无核白中并比较了VpCDPK13转基因葡萄株系和对照葡萄植株(野生型无核白)对白粉菌侵染的响应及对应白粉菌的生长繁殖状况证实了VpCDPK13转基因植株表现出较强抑制白粉菌菌丝生长与分生孢子繁殖的能力，表明了VpCDPK13基因是抗白粉病的钙依赖蛋白激酶基因，其能够提高葡萄的抗白粉病能力。(2)本专利技术专利申请的抗白粉病的VpCDPK13基因能够改良葡萄抗白粉病遗传本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13，其具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。


2.钙依赖蛋白激酶，其由权利要求1所述的分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13编码，所述钙依赖蛋白激酶具有SEQIDNO:13所示的氨基酸序列。


3.权利要求1所述的分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCD...

【专利技术属性】
技术研发人员：文颖强，胡洋，程远，余雪娜，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61