一组拟南芥磷酸核酮糖激酶的突变体制造技术

本发明专利技术涉及一组拟南芥磷酸核酮糖激酶的突变体，所述的突变体为：在如SEQIDNO.1所示的野生型AtPRK蛋白的序列基础上，突变了如下位点形成的突变体：(1)D14A、S15A、K19A、S20A、W156A中的任一或任意组合；(2)D58A、H61A、R65A、R68A、K69A、Y104F、H106A中的任一或任意组合；或(3)上述两组突变位点的任意组合；其中第(1)组突变涉及ATP亲和力的变化，第(2)组突变涉及Ru5P亲和力的变化。本发明专利技术还涉及所述的突变体的应用，(1)构建改变卡尔文循环(暗反应阶段)功能的模型植株；(2)构建植物模型；(3)构建具有改进的固碳功能的植株；(4)催化5‑磷酸核酮糖(Ru5P)为1，5‑二磷酸核酮糖。

A group of Arabidopsis mutants of PKK

【技术实现步骤摘要】
一组拟南芥磷酸核酮糖激酶的突变体
本专利技术属于生物
，具体而言，涉及一组拟南芥磷酸核酮糖激酶的突变体。
技术介绍
光合作用是地球上最为重要的物理化学反应之一，光合生物利用光能将二氧化碳和水转换为碳水化合物。放氧光合生物，如蓝藻，绿藻和高等植物等还能释放出氧气。光合作用分为光反应阶段和暗反应阶段，其中光反应是严格依赖于光的，而暗反应不需要光也能进行。在光反应阶段中，光系统吸收光能，在反应中心裂解水释放出氧气、质子和电子，同时生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和三磷酸腺苷(ATP)。在暗反应阶段，光合生物利用光反应阶段产生的NADPH和ATP，固定二氧化碳，合成糖类，这是一个由多个酶参与的多步催化反应过程，被称为卡尔文循环。虽然卡尔文循环不依赖光，但是需要光反应过程中生成的ATP和NADPH，所以卡尔文循环的进行也受到“光照/黑暗”转换的调控，这一过程主要通过叶绿体类囊体基质中的氧化还原状态变换来调节的。参与卡尔文循环的11个酶中有4个是受到氧化还原调控的，还原态是它们的活性形式，氧化态则是失活状态。在光照条件下，光系统I(PSI)激活“铁氧还蛋白-硫氧还蛋白”氧化还原系统，还原叶绿体中的硫氧还蛋白(TRX)。还原态的硫氧还蛋白可以继续还原并激活卡尔文循环中的酶，其中磷酸核酮糖激酶(PRK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)都受其调控。此外，叶绿体中的一个小蛋白叶绿体蛋白12(chloroplastprotein12，CP12)，作为卡尔文循环调控的中心，也受到硫氧还蛋白的调控。暗反应阶段通常被分为三个过程：二氧化碳固定，三碳糖还原和五碳糖再生。PRK在五碳糖再生过程中起作用。在此过程中，PRK消耗光合作用光反应的产物ATP，将其γ-磷酸基团转移到5-磷酸核酮糖(Ru5P)上，催化生成1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)及二磷酸腺苷(ADP)。RuBP作为固定二氧化碳的酶Rubisco的底物，起始光合作用的二氧化碳固定过程。关于PRK结构和催化机制的研究早在1998年就有报道，但这些研究都是基于非放氧光合细菌紫细菌来源的PRK(RhodobacterspheaeroidesPRK，RsPRK)进行的。放氧光合生物来源的PRK与RsPRK在蛋白序列上的同源度极低，只有17.1％，并且它们的寡聚状态和调控方式方面也截然不同。RsPRK形成同源八聚体，而来源于放氧光合生物的PRK一般以同源二聚体形式存在。且在每个单体中，N端都含有一对受氧化还原调控的半胱氨酸，处于还原态的PRK为活性状态，氧化态的PRK为失活状态；而RsPRK中没有这对半胱氨酸，因而不受氧化还原调控。最近，有研究揭示了蓝藻PCC6301的氧化态PRK结构，以及拟南芥和莱茵衣藻的还原态PRK结构。这些结构说明了放氧光合生物PRK的二体形成形式以及受氧化还原调控的半胱氨酸的位置。在还原态PRK中，两个半胱氨酸分开较远距离，氧化态PRK中两个半胱氨酸形成了二硫键。在激酶中，通常包含一段相对保守的motif，由序列G-x(4)-GK-[TS](Gly-任意四个氨基酸-Gly-Lys-Thr或Ser)组成，这段序列被称为P-loop，通常参与激酶中的ATP结合。在PRK中，一个半胱氨酸(C17)正位于P-loop结构域，当与另一个半胱氨酸(C56)形成二硫键后，可能破坏了PRK中ATP的结合位点，从而导致氧化态PRK失去活性。在光合作用暗反应阶段的三碳糖还原过程中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)可以将1，3-二磷酸甘油酸还原为甘油醛-3-磷酸，这个过程要消耗光合作用光反应产物NADPH。根据序列，GAPDH通常可分为两种类型，分别是GapA和GapB。它们在叶绿体中可以组装成A4和A2B2两种四聚体形式。在蓝藻和真核藻类中，GAPDH只以A4-GAPDH形式存在。这种四聚体状态稳定，具有持续活性，其活性的调节主要通过与CP12形成复合物，此时活性受到抑制。A2B2异源四聚体形式的GAPDH则主要受到TRX的氧化还原调控，但是在部分陆生植物中，其活性也能通过与CP12形成复合物而被抑制。目前已发现CP12存在于多种放氧光合生物中。经典的CP12在序列的中间部分含有一段高度保守片段“AWD_VEE”。还原态CP12是无序蛋白，没有固定结构；氧化态CP12则形成稳定的三维构象，并能够进一步与GAPDH、PRK形成复合物。当植物接受光照时，TRX会还原CP12，还原态的CP12失去二级结构，无法维持复合物的组装，导致复合物解聚。之前的研究表明GAPDH和PRK形成复合物后，PRK的活性受到抑制，但是从复合物中解聚出的PRK能够被快速激活，而游离的氧化态PRK恢复活性相对较慢。截至我们的工作完成之前，这一现象的机制尚不明确。之前的研究指出GAPDH/CP12/PRK复合物的意义不仅在于抑制GAPDH和PRK的活性，其更重要的作用在于植物处于黑暗条件时，为PRK和GAPDH提供储蓄库，保护两种酶在不发挥功能时维持其结构稳定，不被细胞降解，当植物再次受到光照时，复合物解聚使得GAPDH与PRK能快速恢复活性，起始卡尔文循环，保证光合作用高效进行。最近，来源于蓝藻的GAPDH/CP12/PRK复合物整体分辨率的电镜结构已被报道。但该结构中由于PRK与CP12界面处分辨率比较低，不能确定两种蛋白的具体结合细节。另外，尽管目前已有文章报道了放氧光合生物的PRK结构，但是一直没有PRK结合底物及催化辅因子的结构，因而对于ATP和Ru5P与PRK的结合方式，以及PRK的催化机制仍不清楚。我们解析了蓝藻来源的PRK(SynechococcuselongatusPRK，SePRK)的晶体结构，结构中SePRK结合了ADP及PRK底物5-磷酸核酮糖结构相近的小分子葡萄糖-6-磷酸(G6P)，以及拟南芥来源的GAPDH/CP12/PRK复合物(AtGAPDH/CP12/PRK)晶体结构。这两个结构展示了PRK活性位点细节，以及参与PRK-CP12相互作用的结构域。此外，我们还解析了拟南芥来源的还原态和氧化态PRK(ArabidopsisthalianareducedPRK，AtPRKred和ArabidopsisthalianaoxidizedPRK，AtPRKox)结构。通过结构分析，我们构建了大量的PRK突变体，测定了这些突变体相比于野生型PRK的活性变化，以及与底物/辅因子结合能力的差别。结合这些生化实验结果，我们揭示了PRK的催化及调控机制：在氧化态PRK中，ATP结合位点遭到破坏导致PRK失活；而复合物的形成使得CP12结合在了Ru5P位点上，从而导致PRK失活。我们的结构和功能研究大幅提高了人们对PRK催化机制和卡尔文循环的氧化还原调控机制的理解，同时，我们构建的突变体也表现出与野生型PRK不一样的催化活性，可以进一步应用于采用生物技术手段改造作物，达到提高光合作用暗反应阶段的固碳效率，提高作物产量的目的。
技术实现思路
本专利技术首先涉及一组拟南芥植物的磷酸核酮糖激酶(AtPRK)的几种突变体，所述的突变体为：在如SEQIDNO.1所示的野生型AtPRK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拟南芥植物的磷酸核酮糖激酶(AtPRK)的突变体，所述的突变体为：在如SEQ IDNO.1所示的野生型AtPRK蛋白的序列基础上，突变了如下位点形成的突变体：/n(1)D14A、S15A、K19A、S20A、W156A中的任一或任意组合；/n(2)D58A、H61A、R65A、R68A、K69A、Y104F、H106A中的任一或任意组合；/n或(3)上述两组突变位点的任意组合。/n

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥植物的磷酸核酮糖激酶(AtPRK)的突变体，所述的突变体为：在如SEQIDNO.1所示的野生型AtPRK蛋白的序列基础上，突变了如下位点形成的突变体：
(1)D14A、S15A、K19A、S20A、W156A中的任一或任意组合；
(2)D58A、H61A、R65A、R68A、K69A、Y104F、H106A中的任一或任意组合；
或(3)上述两组突变位点的任意组合。


2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体序列为：
在如SEQIDNO.1所示的野生型PRK蛋白的序列基础上，突变了如下氨基酸位点：D58A或R65A或Y104F或H106A；
或在如SEQIDNO.1所示的野生型PRK蛋白的序列基础上，突变了如下氨基酸位点：K19A或W156A；
或在如SEQIDNO.1所示的野生型PRK蛋白的序列基础上，突变了如下氨基酸位点：S15A或S20A；
或在如SEQIDNO.1所示的野生型PRK蛋白的序列基础上，突变了如下氨基酸位点：K69A。


3.拟南芥植物磷酸核酮糖激酶同源蛋白的突变体，所述突变体的突变位点为：在所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李梅，常文瑞，于爱玲，解媛，潘晓伟，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11