一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法技术

本发明专利技术公开了一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法。本发明专利技术方法包括：将目标寡糖的非还原末端Gal进行α1,2‑岩藻糖基化修饰从而使底物可以被α1,3‑N‑乙酰氨基半乳糖糖基转移酶或α1,3‑半乳糖糖基转移酶识别合成GalNAc(Fucα1,2)α1,3Gal或Gal(Fucα1,2)α1,3Gal糖苷键，再脱除岩藻糖，从而合成含GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键的目标寡糖。本发明专利技术将酶法合成所具有的高区域选择性和高效性结合到一起，以较高的收率实现了目标分子的合成。且本发明专利技术中所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性宽、催化效率高等优点，可用于大量制备。

A synthesis method of GalNAc \u03b1 1,3gal or gal \u03b1 1,3gal glycoside linked oligosaccharides

【技术实现步骤摘要】
一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法
本专利技术属于糖苷键合成
，具体涉及一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。细胞表面有丰富的糖链，糖链在细胞识别、细胞免疫、病毒感染等方面具有重要生物意义。细胞表面糖链异常表达与癌细胞也有十分重要关系，研究表明含有末端GalNAcα1,3Gal糖苷键的寡糖是宫颈癌预后的指标，再如动物细胞表面的Galα1,3Gal抗原表位是引起人与动物异种移值排斥反应的主要原因。鉴于上述情况，大量合成含GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键的寡糖，发掘其潜在的糖链化合物库，发展以其为先导化合物的肿瘤诊断探针、抗肿瘤新型药物及用于人体异种移植研究具有重大意义。由于生物体内环境十分复杂，就目前的研究水平而言，以提取的方式从生物体内获得大量结构单一的目标寡糖用于生物学、药学研究的可能性微乎其微。对于化学合成而言，由于糖链本身固有的活性相似的多羟基结构，在合成过程中需要反复的保护以及脱保护操作来保证区域、立体选择性，导致其反应步骤多、总体收率低。以酶法模块化组装策略合成复杂寡糖可以克服化学合成法的不足，但就目前酶的来源和实际应用的角度来说，合成寡糖链所应用的酶主要分为两类：一种是糖苷酶，该类酶来源丰富、性能稳定、反应简单、底物适应性强，目前在工业上已被采用，但此类酶催化的寡糖合成收率欠佳。此外，由于糖苷酶催化的转糖基反应的区域选择性不高，而且合成反应中还存在水解反应的竞争，导致产物不均一，难于分离纯化，限制了其广泛应用。第二种是糖基转移酶，该类酶具有很高的催化效率及严格的底物选择性。但是天然糖基转移酶的使用也存在着很多限制因素：酶的来源有限；酶的不稳定性、复杂性导致分离纯化困难；酶催化的糖苷化反应需要价格昂贵的核苷活化糖作糖基给体；酶具有严格的底物特异性，对非天然或异常的底物耐受能力较差。以上缺点极大地限制了糖苷酶和糖基转移酶在酶法模块化合成复杂寡糖中的应用。目前来说，并没有发现直接催化合成GalNAcα1,3Gal糖苷键的糖苷酶或糖基转移酶，合成Galα1,3Gal糖苷键的糖基转移酶也有有限的底物适应性。
技术实现思路
基于上述研究背景，专利技术人认为寻求一种可行、高效合成GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键的方法是目前亟待解决的问题。针对该技术问题，本专利技术利用α1,3-N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶(BgtA)或α1,3-半乳糖糖基转移酶(GTB)将N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)或半乳糖(Gal)分别以α1,3糖苷键引入到非还原末端的Fucα1,2Gal糖苷键单元中Gal的3位OH上，再以一定方法脱除α1,2-Fuc基团，即可实现GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键的构建。本专利技术第一方面，提供一种酶法组装模块A，此模块包含的酶有岩藻糖激酶(FKP)、糖核苷生成酶(BLUSP)、α1,2-岩藻糖糖基转移酶(Hmα1,2FucT)，用于合成Fucα1,2Gal糖苷键。本专利技术第二方面，提供一种酶法组装模块B，此模块包含的酶有N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)与糖核苷生成酶(GlmU)的融合酶(NahK/GlmU)、α1,3-N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶(BgtA)，用于合成GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键。本专利技术第三方面，提供一种酶法组装模块C，此模块包含的酶有半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)、α1,3-半乳糖糖基转移酶(GTB)，用于合成Galα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键。本专利技术第四方面，提供一种酸解岩藻糖模块D，此模块所用的酸是0.04～0.06M的盐酸水溶液，所用设备是微波反应器，温度是105～115℃，反应时间是14～16min；此模块所用的酸还可以是12％～48％的氢氟酸溶液，温度是10～30℃，反应时间是1～8h，用于水解GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal或Galα1,3(Fucα1,2)Gal中的α1,2-Fuc糖苷键。本专利技术第五方面，提供第一、第二、第三、第四方面所述酶法组装模块及酸解岩藻糖模块的具体应用，用于合成GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键。本领域目前糖链的合成主要通过化学法合成和酶法合成来实现，化学法产率较低且面临频繁的保护基操作而酶法合成通常面临酶的来源有限及底物适应性有限等问题。为了克服化学法合成和酶法合成的不足，专利技术人研究团队采用细菌来源的糖基转移酶，构建了针对不同糖砌块的多酶合成模块，合成岩藻糖基化的糖链，再通过包括但不限于化学法将岩藻糖脱除得到目标糖链产物。原理如附图1-4所示，上述酶法模块化组装能够实现岩藻糖、N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖等的定点偶联效果，酸解法可以实现岩藻糖的脱除效果。本专利技术第六方面，提供一种糖链核心骨架末端Gal进行α1,2-岩藻糖基化合成方法，所述合成方法包括将岩藻糖以α1,2糖苷键平行偶联到式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)所示的多糖非还原末端二糖，平行合成式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VII)所示的多糖非还原末端三糖的步骤；优选的，第六方面所述α1,2-岩藻糖基化合成方法通过第一方面所述酶法组装模块A进行合成。在本专利技术的一个具体实施方案中，式(I)所示的β-构型的糖苷Galβl,3GlcNAcOR1的合成采用以下方法：将GlcNAcβProN3(图5所示)与半乳糖(1.2-5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、β1,3-半乳糖糖基转移酶(BiGalHexNAcP)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(I)所示的二糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图8所示。在本专利技术的一个具体实施方案中，式(II)所示的β-构型的糖苷Galβl,4GlcNAcOR1的合成方法为：将GlcNAcβProN3(图5所示)与半乳糖(1.2-5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1,4-半乳糖糖基转移酶(NmLgtB)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(II)所示的二糖。其可作为下步酶反应受本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶法组装模块A，其特征在于，所述酶法组装模块A包含的酶有岩藻糖激酶(FKP)、糖核苷生成酶(BLUSP)、α1,2岩藻糖糖基转移酶(Hmα1,2FucT)，用于合成Fucα1,2Gal糖苷键。/n

【技术特征摘要】
1.一种酶法组装模块A，其特征在于，所述酶法组装模块A包含的酶有岩藻糖激酶(FKP)、糖核苷生成酶(BLUSP)、α1,2岩藻糖糖基转移酶(Hmα1,2FucT)，用于合成Fucα1,2Gal糖苷键。


2.一种酶法组装模块B，其特征在于，所述酶法组装模块B包含的酶有N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)与糖核苷生成酶(GlmU)的融合酶(NahK/GlmU)、α1,3N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶(BgtA)，用于合成GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键。


3.一种酶法组装模块C，其特征在于，所述酶法组装模块C包含的酶有半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)、α1,3半乳糖糖基转移酶(GTB)，用于合成Galα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键。


4.一种酸解岩藻糖模块D，其特征在于，所述酸解岩藻糖模块D所用的设备是微波反应器，溶剂是0.04～0.06M的盐酸水溶液，温度是105～115℃，反应时间是14～16min,用于水解Fucα1,2Gal糖苷键。或用氢氟酸水溶液酸解岩藻糖，溶剂是12％～48％氢氟酸水溶液，温度为10～30℃，反应时间为1～8h。


5.权利要求1，2，3，4任一项所述酶法组装模块及酸解岩藻糖模块的应用。


6.一种糖链核心骨架末端Gal进行α1,2岩藻糖基化合成方法，其特征在于，所述合成方法包括将岩藻糖以α1,2糖苷键平行偶联到式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)所示的多糖非还原末端二糖，合成式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VII)所示的多糖非还原末端三糖的步骤；



优选的，所述α1,2岩藻糖基化合成方法通过权利要求1所述酶法组装模块A进行合成。


7.一种糖链核心骨架末端GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括将N-乙酰氨基半乳糖分别以以α1,3糖苷键平行偶联到式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)所示的多糖非...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹鸿志，刘新亮，刘长城，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37