【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNA聚合酶变体相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年8月18日提交的美国临时申请号62/547,677、2018年2月9日提交的美国临时申请号62/628,484，以及2018年3月5日提交的美国临时申请号62/638,684，2018年5月29日提交的美国临时申请号62/677,527的优先权，所述临时申请的每一者通过引用以其全文并入本文。
技术介绍
体外转录(IVT)使用噬菌体DNA依赖性核糖核酸(RNA)聚合酶(例如SP6、T3和T7)合成模板指导的mRNA转录物。IVT反应中的问题可能导致完全失败(例如，未产生转录物)或转录物大小不正确(例如，比预期的短或长)。与IVT反应相关的具体问题包括例如在反应期间产生的流产性(截短)转录物、连缀转录物、polyA尾部变体/3′异质性、突变转录物和/或双链污染物。RNA聚合酶展现出三个转录阶段-起始、延伸和终止。在起始阶段期间，RNA聚合酶与特定启动子DNA序列结合，打开DNA双链体，并且将模板链送入活性位点中。例如，T7RNA聚合酶形成称为起始复合物的结构，该结构包括六螺旋束子结构域(启动子结合结构域)，该六螺旋束子结构域与启动子相互作用以引发DNA双链体解链。当与启动子结合时，聚合酶产生许多2-12个核苷酸(nt)长的短(截短)转录物，这一过程通常称为流产性合成/起始。截短的RNA转录物不能通过RNA聚合酶转化为全长转录物，而成为在转录期间积聚的副产物。在转变到延伸阶段并释放启动子之后，聚合酶沿着DNA模板向下进行，从而产生全长RNA转录物。
【技术保护点】
1.一种核糖核酸(RNA)聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含氨基酸取代，所述氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170818 US 62/547,677;20180209 US 62/628,484;20181.一种核糖核酸(RNA)聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含氨基酸取代，所述氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化。
2.如权利要求1所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代相对于野生型氨基酸具有较高的螺旋倾向性。
3.如权利要求1或2所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述环结构呈C螺旋结构。
5.如权利要求1-4中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述环结构呈C接头结构。
6.如权利要求1-4中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代是高螺旋倾向性氨基酸取代。
7.如权利要求6所述的RNA聚合酶变体，其中所述高螺旋倾向性酸取代选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸。
8.如权利要求7所述的RNA聚合酶变体，其中所述高螺旋倾向性氨基酸取代是丙氨酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述T7RNA聚合酶变体包含与SEQIDNO：1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的RNA聚合酶变体，其中所述T7RNA聚合酶包含与SEQIDNO：1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以包含在选自E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、A258、G259、A260、L261以及A262的位置处的高螺旋倾向性氨基酸的氨基酸取代。
11.如权利要求10所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代包括S43A。
12.如权利要求10所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代包括G47A。
13.如权利要求1-12中任一项所述的RNA聚合酶变体，其进一步包含额外的C末端氨基酸。
14.如权利要求13所述的RNA聚合酶变体，其中所述额外的C末端氨基酸包括甘氨酸(G)。
15.如权利要求11、13或14中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体包含SEQIDNO：108的氨基酸序列。
16.如权利要求12-14中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体包含SEQIDNO：110的氨基酸序列。
17.一种核糖核酸(RNA)聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含额外的C末端氨基酸。
18.如权利要求17所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体是T7RNA聚合酶变体。
19.如权利要求18所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体与野生型T7RNA聚合酶具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
20.如权利要求17或18所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体相对于野生型T7RNA聚合酶包含氨基酸取代。
21.如权利要求17-20中任一项所述的RNA聚合酶变体，其包含两个额外的C末端氨基酸。
22.如权利要求21所述的RNA聚合酶变体，其中所述两个额外的C末端氨基酸包括相同类型的氨基酸或两个不同类型的氨基酸。
23.如权利要求17-22中任一项所述的RNA聚合酶变体，其包含1-5个或1-10个额外的C末端氨基酸。
24.一种RNA聚合酶变体，其包含C末端，所述C末端包含FAFAXn基序，其中X是任何氨基酸并且n是大于零的任何整数。
25.如权利要求24所述的RNA聚合酶变体，其中X是G或A。
26.如权利要求24或25所述的RNA聚合酶变体，其中n是大于零的任何整数，任选地其中n是1、2、3、4或5。
27.一种RNA聚合酶变体，任选地T7RNA聚合酶变体，其包含C末端，所述C末端包含FAFAG基序。
28.一种RNA聚合酶变体，任选地T7RNA聚合酶变体，其包含C末端，所述C末端包含XAFAXn基序、FXFAXn基序、FAXAXn基序或FAFXXn基序，其中每个X是任何氨基酸，并且n是大于零的任何整数。
29.如权利要求17-28中任一项所述的RNA聚合酶变体，其进一步包含氨基酸取代。
30.如权利要求29所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代是选自野生型RNA聚合酶的E42、S43、Y44、E45、M46、G47、R257、A258、G259、A260、L261和A262的位置处的高螺旋倾向性氨基酸，任选地其中所述野生型RNA聚合酶包含SEQIDNO：1的氨基酸序列或与SEQIDNO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
31.如权利要求30所述的RNA聚合酶变体，其中所述高螺旋倾向性氨基酸是丙氨酸。
32.如权利要求31所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代是S43A或G47A。
33.一种产生核糖核酸(RNA)的方法，其包括使DNA模板与如权利要求1-32中任一项所述的RNA聚合酶在导致产生RNA转录物的条件下接触。
34.一种进行体外转录(IVT)反应的方法，所述方法包括在存在三磷酸核苷和缓冲液的情况下，使DNA模板与如权利要求1-32中任一项所述的RNA聚合酶在导致产生RNA转录物的条件下接触。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所产生的所述RNA转录物在任选地以未纯化形式递送至细胞中时刺激相对于使用野生型RNA聚合酶所产生的RNA低至少50％的细胞因子应答。
36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所产生的双链RNA(dsRNA)转录物的浓度相对于使用野生型聚合酶产生的dsRNA转录物低至少50％。
37.如权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所产生的RNA转录物的小于20％展现出3′异质性。
38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所产生的RNA转录物的小于50％是双链污染物。
39.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所产生的RNA转录物的小于50％是连缀RNA转录物。
40.如权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所产生的全长RNA转录物的量比所述DNA模板的量大至少15倍。
41.如权利要求33-40中任一项所述的方法，其中所产生的双链污染物：全长RNA转录物的比率小于1∶1。
42.如权利要求33-41中任一项所述的方法，其中所产生的所述RNA转录物相对于所述DNA模板每100个核苷酸具有少于1个突变。
43.一种核酸，其编码如权利要求1-32中任一项所述的RNA聚合酶变体。
44.一种载体，其包含如权利要求43所述的核酸。
45.一种宿主细胞，其包含如权利要求43所述的核酸或如权利要求44所述的载体。
46.一种组合物或试剂盒，其包含如权利要求1-32中任一项所述的RNA聚合酶变体和任选地体外转录(IVT)试剂。
47.一种核糖核酸(RNA)，任选地信使RNA(mRNA)，其通过如权利要求33-42中任一项所述的方法产生。
48.如权利要求47所述的RNA，其被配制在脂质纳米颗粒中，任选地其中所述脂...
【专利技术属性】
技术研发人员：埃米·E·拉比多，阿萨纳西奥斯·杜西斯，干乍那·拉维钱德兰，埃莉萨·霍伯特，
申请(专利权)人：摩登纳特斯有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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