一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用，本发明专利技术利用NdeΙ和HindⅢ将ppk2基因插入到原核表达载体pET30a中，重组表达载体通过物理法转入大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中，利用IPTG诱导目的蛋白PPK2在37℃、25℃和16℃下试表达，并通过SDS‑PAGE电泳和Western Blotting鉴定分析表达产物；最后，利用3.2L表达菌液进行放大培养，表达产物先后经Ni‑IDA亲和色谱柱、阳离子交换色谱柱和凝胶过滤色谱柱分离纯化。结果显示：大肠原核表达系统可在16℃、终浓度为0.2mM·L

PPK2 protein and its application as 30kd standard in polyacrylamide gel electrophoresis

【技术实现步骤摘要】
一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用。
技术介绍
蛋白标准品的主要作用是用来指示蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳泳道上蛋白条带所对应的分子量大小，是阳性对照，只有标准品准确无误，实验结果才有说服力。除此之外，蛋白标准品还有表示WesternBlotting时转膜成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等作用，所以选择正确的蛋白标准品是分子生物学实验取得成功的必要条件之一。多聚磷酸激酶2(Polyphosphatekinase2,PPK2)在众多病原菌的致病性中发挥重要作用，而人等后生动物体内未发现ppk2基因，因而PPK2是新型抗生素开发的靶点。但以PPK2蛋白作为聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准品的相关研究未见报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种PPK2蛋白，所述PPK2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提出一种如上所述的PPK2蛋白的编码基因。可选地，所述PPK2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示：本专利技术还进一步提出一种包含如上所述PPK2蛋白的编码基因的表达载体或表达工程菌。可选地，所述PPK2蛋白表达载体是将上述PPK2蛋白的编码基因插入到原核细胞表达质粒的NdeΙ和HindⅢ酶切位点之间得到。可选地，所述原核细胞表达质粒选用pET30a作为亲本表达载体。本专利技术还提出如上所述的PPK2蛋白在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用。本专利技术还提出如上所述的PPK2蛋白的制备方法，如下所述：重组表达质粒PPK2/pET30a通过物理法转入大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中，利用0.2mM·L-1终浓度的IPTG诱导3.2L表达菌株(液)中的目的蛋白PPK2在16℃下表达，经系列色谱法纯化后浓度可达10mg·mL-1，纯度为95％。本专利技术的优点和有益效果为：1、将PPK2蛋白与WesternBlotting电泳标准品14～100kd(100、70、50、40、30、25、14)一同进行SDS-PAGE电泳分析，发现PPK2蛋白条带清晰，泳道上无其它条带，且位于30kd处。2、将PPK2蛋白与常用SDS-PAGE电泳标准品12～80kd(12、20、30、40、60、80)一同进行SDS-PAGE电泳分析，发现PPK2蛋白条带染色完全，条带清晰，所在泳道无其它条带，且正好位于30kd处。3、阳离子交换色谱和凝胶过滤色谱分析表明，PPK2蛋白带电性质专一，在溶液中以单体形式存在，性质稳定，不易发生降解，半衰期长。这与部分已商用的单条带蛋白标准品相比具有明显优势，有些商用的标准品在使用过程中会发生降解，导致电泳结束后凝胶上没有标准品条带。4、如前所述利用3.2L表达菌液即可纯化出浓度为10mg·mL-1，纯度为95％的PPK2蛋白，可见采用大肠杆菌原核表达系统表达PPK2蛋白的效率很高，适合利用该系统制备PPK2蛋白标准品。附图说明图1：PPK2/pET30a重组表达载体图谱。图2：PPK2/pET30a重组表达质粒双酶切鉴定。C：对照(重组表达质粒)；PD：重组质粒的NdeΙ和HindⅢ双酶切；M：DNA标志物。图3：SDS-PAGE分析PPK2蛋白试表达情况。M：蛋白分子质量标准；C：对照(未加IPTG)；T1：16℃诱导16h；T2：25℃诱导16h；T3：37℃诱导16h。图4：WesternBlotting鉴定PPK2蛋白16℃下表达情况。WM：WesternBlotting蛋白分子质量标准；T1：16℃诱导16h。图5：PPK2过Ni-IDA亲和柱纯化结果。s：全菌破菌离心后上清；ie：上清同Ni-IDA孵育后流出液；M：蛋白分子质量标准；A1：50mM·L-1咪唑洗脱组分；A2-A3：100mM·L-1咪唑洗脱组分；A4-A8：300mM·L-1咪唑洗脱组分。图6：PPK2蛋白的阳离子交换色谱纯化。图7：阳离子交换色谱纯化PPK2蛋白的SDS-PAGE分析。S22-S26：蛋白收集管；M：蛋白分子质量标准。图8：PPK2蛋白的凝胶色谱纯化。图9：凝胶色谱纯化PPK2蛋白的SDS-PAGE分析。D24-D30：24-30蛋白收集管；M：蛋白分子质量标准。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案。目的基因与质粒：以质粒pET30a作为表达载体(卡那霉素抗性，PPK2蛋白N端仅含有6×His标签，纯化过程中未切除)，PPK2目的基因由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。主要试剂：限制性核酸内切酶(NdeΙ、HindⅢ)和DNAMarker购自美国Thermo公司；SDS-PAGEMarker、WesternBlottingMarker均购自全式金(北京)生物技术有限公司；DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术(上海)有限公司；AKTA蛋白纯化仪、Ni-IDA亲和柱、阳离子交换柱HitrapSP以及凝胶过滤色谱柱Superdex200Increase10/300GL均购自美国GE公司。实施例1：生物信息学预测从NCBI数据库获得PPK2蛋白的氨基酸序列后(WP_AGG33389.1)，利用PSIPRED网站(http://web.expasy.org/protparam)预测PPK2蛋白的二级结构；利用ExPASy网站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测PPK2基本理化性质。实施例2：全质粒酶切和测序利用限制性核酸内切酶NdeΙ和HindⅢ酶切由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成的重组表达质粒PPK2/pET30a以进行质粒双酶切鉴定，在DNA琼脂糖凝胶电泳实验的结果中应有一个5250bp的条带和1个798bp的条带；同时，将PPK2/pET30a重组表达质粒交由金维智生物科技有限公司完成目的基因PPK2测序工作。最终，确认重组表达载体的准确性。实施例3：PPK2蛋白试表达与鉴定将上述构建正确的重组表达质粒PPK2/pET30a转化到大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含50μg·mL-1的卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4ml的LB培养基中(含50μg·mL-1的卡那霉素)，于37℃、220r/min恒温摇床中培养，待培养至OD600值为0.5-0.8时，向试管培养液中加入IPTG使其终浓度为0.2mM·L-1，之本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PPK2蛋白，其特征在于：所述PPK2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种PPK2蛋白，其特征在于：所述PPK2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种如权利要求1所述的PPK2蛋白的编码基因，其特征在于：所述PPK2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


3.一种包含如权利要求2所述的PPK2蛋白的编码基因的表达载体或表达工程菌。


4.一种如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫东科，宫艳超，许凤霞，李陇梅，吕平，李冬，
申请(专利权)人：天津市职业大学，
类型：发明
国别省市：天津;12