一株巨大芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一株巨大芽孢杆菌及其应用专利申请。巨大芽孢杆菌YSJ3,该菌株于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 19088。本申请中，发明专利技术人在现有巨大芽孢杆菌YSJ1菌株基础上，通过紫外诱变和等离子束诱变技术的组合应用及定向筛选育种，最终获得了一株具有较好生长活力的巨大芽孢杆菌YSJ3菌株。初步实验结果表明，YSJ3菌株最高发酵活力可达150亿/mL以上，表现出较好生长效果，可为巨大芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。

A giant bacillus and its application

【技术实现步骤摘要】
一株巨大芽孢杆菌及其应用
本专利技术属于生物发酵工程
，具体涉及一株巨大芽孢杆菌及其应用专利申请。
技术介绍
巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium），是一种好氧、产芽孢的革兰氏阳性细菌，菌体直径大于1.0μm，俗称“大芽孢”菌，是一种有益的土壤细菌，现有研究认为该菌对于促进作物生产、改善作物品质具有较好用处。因此近年来对于该菌的研究和应用得到了一定程度重视。但受限于现有该菌生长活力较弱、生长速度较慢、发酵产量较低等制约，限制了以该菌为主的微生物制剂的生产应用。因而极有必要筛选具有更好生长效果的巨大芽孢杆菌菌株以及对该菌株的发酵工艺进行进一步优化，从而为相关微生物制剂产品的生产应用奠定技术基础。
技术实现思路
基于现有巨大芽孢杆菌，通过对其诱变、筛选，本申请目的在于提供一株具有更好生长活力的巨大芽孢杆菌，从而为相关生物有机肥、微生物制剂、抗生素合成以及酶工业生产应用奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一株巨大芽孢杆菌，其具体名称为：巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）YSJ3,该菌株已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC19088；该菌株是通过对原始出发菌株巨大芽孢杆菌YSJ1进行多次紫外诱变和等离子束复合诱变育种选育获得的。利用所述巨大芽孢杆菌所制备发酵产物，通过如下步骤制备获得：（1）菌株活化和制备种子液将所保存的巨大芽孢杆菌YSJ3菌株在LB平板培养基中，37℃活化培养24h后，收集菌苔转接于LB液体培养基中进一步扩增后，转接于种子罐的种子培养基中，37℃、180-300rpm发酵15h左右作为种子液；所述种子培养基为（质量百分比）：葡萄糖2%，玉米粉3％，豆饼粉5％，玉米浆干粉1%，磷酸二氢钾0.2％，酵母粉1.5%，pH7.0；（2）制备发酵液按照10%体积比接种量，将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，在发酵罐内，30~38℃、180-200rpm发酵至24~48h制备发酵液（37℃、180-200rpm发酵至30h左右至芽孢形成率在80%以上，同时发酵液的pH明显升高时即可放罐）；为便于后续制备微生物制剂成品，可在发酵醪液中加入2%质量分数的无水硫酸钠充分搅拌均匀后进一步转入乳化罐中，喷雾干燥处理（具体喷雾干燥处理工艺参考参数为：进风温度控制在：140-170℃，排风温度控制在60-65℃，负压200-500pa），进一步制备成粉末状原粉，并与其他辅料或有效成分复配后作为巨大芽孢杆菌成品制剂；所述发酵培养基，为液态，以质量百分比计，具体成分包括：玉米粉5~8%，豆饼粉9~12%，麸皮0.5~1.5％，氯化钙0.03％，磷酸二氢钾0.1~0.5%，硫酸锰0.01~0.03%，pH6.5~7.2。所述巨大芽孢杆菌或其发酵产物在作物栽培中应用，作为有益微生物菌肥应用，可明显改善作物表型或者促进产量提高，具体例如用于烟草栽培。本申请中，专利技术人在现有巨大芽孢杆菌YSJ1菌株（早期由渑池县天池烟草基地土壤中分离筛选获得，该菌株菌落椭圆形、表面光滑、边缘整齐，镜检芽孢囊不膨大，芽孢椭圆形）基础上，通过紫外诱变和等离子束诱变技术的组合应用及定向筛选育种，最终获得了一株具有较好生长活力的巨大芽孢杆菌YSJ3菌株。初步实验结果表明，YSJ3菌株最高发酵活力可达150亿/mL以上，表现出较好生长效果，可为巨大芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。附图说明图1为巨大芽孢杆菌生长曲线图。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分实验背景情况简要说明如下。培养基：营养琼脂培养基（NutrientAgar.NA）：蛋白胨10.00g，牛肉提取物3.00g，氯化钠5.00g，琼脂15.00g，蒸馏水1.00L，pH7.0；牛肉浸汁培养基（Bee4.3extractAgar）：取去脂肪的瘦肉500.00g，切碎，于烧杯中加蒸馏水1.00L，置4℃冰箱中过夜，用棉花过滤，将滤液于水浴中煮沸1h，使蛋白质凝固，过滤，在滤液中加入10.00g蛋白胨和5.00g氯化钠，调pH7.4，并将液体补足1.00L，琼脂15.00g，分装后灭菌，备用；巨大芽孢杆菌活力测定方法采用稀释倒平板法，按10倍稀释法制成不同浓度稀释液，从稀释液中分别吸取一定体积置于无菌培养皿中，每一稀释度做3次重复；随后将事先融化并冷却至50℃左右的营养琼脂培养基，向每个培养皿中倒入约12mL，摇匀，待凝固后，倒置培养24h，进行菌落计数；对培养后的每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色，进行显微镜识别；选择适宜的稀释度、菌落在30～300个之间的平板进行计数；结果计算方法：。实施例1本实施例就本申请所提供的巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）YSJ3菌株诱变筛选获得过程简要介绍如下。本申请所提供的巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）YSJ3主要是通过对现有出发菌株巨大芽孢杆菌YSJ1的紫外线诱变和离子束诱变筛选获得的，具体诱变、筛选过程简要说明如下。（1）紫外线诱变首先是对出发菌株巨大芽孢杆菌YSJ1进行紫外线诱变育种，其主要过程为：取37℃培养至对数生长期的YSJ1菌悬液4ml，采用15W紫外线灯在28cm距离处照射，照射过程中，随着紫外线照射时间的延长，菌株存活率逐渐降低。辐射诱变过程中，以辐照40s时长作为紫外线诱变剂量（测定结果表明，当照射时间超过40s时，存活率低于10%，因此选择此时长作为最佳时长）。经过多轮辐照、初筛、复筛等诱变筛选后，获得一株具有较高活力突变菌株，将其命名为YSJ1-507。测定结果表明，其发酵活力为83亿/mL。（2）离子束诱变以紫外诱变获得的YSJ1-507菌株作为离子束诱变的出发菌株，具体诱变、筛选过程为：取出发菌株YSJ1-507培养至对数生长期的菌液5mL，过滤、用无菌生理盐水重悬浮后，取200uL菌悬液于无菌培养皿中，均匀涂布于培养皿中间位置，无菌操作台中自然晾干，然后分别按照5×1014ions·cm-2、1×1015ions·cm-2、5×1015ions·cm-2、1×1016ions·cm-2、5×1016ions·cm-2五个剂量进行离子束照射，照射时间分别为18s、36s、179s、368s、1790s；照射结束后用生理盐水进行洗脱，并将洗脱后诱变菌株涂布在培养基上，37℃培养2天；最终筛选获得5株菌落形态好，生长速度快的新菌株，分别命名为：YSJ2-107、YSJ2-219、YSJ2-505、YSJ2-326、YSJ2-432。...

【技术保护点】
1.一株巨大芽孢杆菌，其特征在于，具体名称为：巨大芽孢杆菌YSJ3, 该菌株于 2019年 12 月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 19088。/n

【技术特征摘要】
1.一株巨大芽孢杆菌，其特征在于，具体名称为：巨大芽孢杆菌YSJ3,该菌株于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC19088。


2.利用权利要求1所述巨大芽孢杆菌所制备发酵产物，其特征在于，通过如下步骤制备获得：
（1）菌株活化和制备种子液
将所保存的巨大芽孢杆菌YSJ3菌株活化培养后，接种于种子培养基中制备种子液；
（2）制备发酵液
按照10%体积比接种量，将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，在发酵罐内，30~38℃、180-200rpm发酵至24~48h制备发酵液。


3.如权利要求2所述利用巨大芽孢杆菌所制备发酵产物，其特征在于，步骤（1）中，质量百分比计，所述种子培养基为：葡萄糖2%，玉米粉3％，豆饼粉5％，玉米浆干粉1%，磷酸二氢钾0...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙利鹏，管宁，陈晓宇，梁颖杰，郭蒙恩，邹瑞瑞，艾超峰，
申请(专利权)人：河南新仰韶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41