一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用专利申请。多粘类芽孢杆菌YSD7，于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 19087。该菌可防治：大白菜软腐病菌、芋头软腐病菌、烟草疫霉、花卉根腐病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌或玉竹根腐病菌。发明专利技术人在现有菌株基础上，通过紫外诱变和硫酸二乙酯诱变技术的组合应用及定性筛选育种，最终获得了一株具有较好生长活力的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株。初步实验结果表明，YSD7菌株最高发酵活力可达95亿/mL，表现出较好生长效果，可为多粘类芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。

A Bacillus polymyxoides with high yield and its application

【技术实现步骤摘要】
一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用
本专利技术属于生物发酵工程
，具体涉及一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用专利申请。
技术介绍
多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa），是一种可产芽孢的、生理特性多样的、革兰氏阳性杆状细菌，当其以芽孢形式存在时，具有耐温性好、质量稳定优点。多粘类芽孢杆菌也是一种土壤与植物微生态之间的常见优势菌，因此在青枯病、枯萎病、根腐病、软腐病等土传病害防治方面有较多研究和应用，加之其具有促生长、提产量、改善品质、无残留等特点，因此以多粘类芽孢杆菌为主的微生物制剂是无公害、绿色、有机蔬菜生产中首选防治药剂。美国环境保护署(EPA)也将其列为可商业上应用的微生物种类之一。多粘类芽孢杆菌虽然是一种良好的生防促生菌，具有较好的市场前景和极高的应用价值，但受限于现有多粘类芽孢杆菌发酵产量偏低等技术问题，实际的以多粘类芽孢杆菌为主的微生物制剂产品类型仍然较为有限，进而限制了此类微生物制剂产品在实际生产中的推广应用，因而极有必要筛选具有更好生长效果的多粘类芽孢杆菌菌株以及对该菌株的发酵工艺进行进一步优化，从而为相关微生物制剂产品的生产应用奠定技术基础。
技术实现思路
基于现有多粘类芽孢杆菌，通过对其诱变、筛选，本申请目的在于提供一株具有更好生长活力的多粘类芽孢杆菌菌株，从而为相关微生物制剂产品的生产、制备奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一株高产多粘类芽孢杆菌，其名称为：多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）YSD7，该菌株已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC19087；该菌株是通过对原始出发菌株多粘类芽孢杆菌YSD5进行多次紫外诱变和硫酸二乙酯复合诱变育种选育获得的。利用所述高产多粘类芽孢杆菌所制备发酵液，通过如下步骤制备获得：（1）菌株活化和制备种子液将所保存的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株在LB平板培养基中，30℃活化培养2d后，搜集菌苔转接于LB液体培养基中进一步扩增后，转接于种子罐的种子培养基中，30℃、180-300rpm发酵18h左右作为种子液；所述种子培养基为：葡萄糖2%，玉米粉3％，豆饼粉5％，玉米浆干粉1%，磷酸二氢钾0.2％，酵母粉1.5%，pH7.0；（2）制备发酵液按照6%体积比接种量，将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，在发酵罐内，28~35℃、180-200rpm发酵24~48h（优选条件下，30℃、180-200rpm发酵至35h左右即可）左右至芽孢形成率在80%以上（同时发酵液的pH会明显升高）时放罐，即为发酵液；为便于后续制备微生物制剂成品，可将发酵醪液进一步转入乳化罐中，采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥处理（喷雾干燥具体处理参数可参考设置为，进风温度控制在：140-170℃，排风温度控制在65-70℃，负压200-400pa），进一步制备成粉末状原粉，并与其他辅料或有效成分复配后作为多粘类芽孢杆菌成品制剂；所述发酵培养基，为液态，以质量比计，具体成分包括：葡萄糖0.5~2%，玉米粉4~6%，玉米浆干粉1~2%，豆饼粉3~6%，酵母粉1~3%，磷酸二氢钾0.1~0.5%，氯化锰0.01~0.03%，pH6.5~7.0。所述高产多粘类芽孢杆菌在制备植物病原菌防治药剂中的应用，用于防治：大白菜软腐病菌、芋头软腐病菌、烟草疫霉、花卉根腐病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌或玉竹根腐病菌等病原菌；以防治大白菜软腐病菌为例，具体用法为：将YSD7菌株制备成活菌数为2.0-8.0亿个/mL的菌液，按每100g大白菜种子15ml菌液量，将大白菜种子在菌液中浸泡不少于1h。本申请中，专利技术人在现有多粘类芽孢杆菌YSD5菌株（早期由申请人韶山工厂附近林地腐殖土中筛选获得，表型特征为：菌落呈圆形，微隆起，边缘整齐，表面粘稠、湿润、色暗）基础上，通过紫外诱变和硫酸二乙酯诱变技术的组合应用及定性筛选育种，最终获得了一株具有较好生长活力的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株。初步实验结果表明，YSD7菌株最高发酵活力可达95亿/mL，表现出较好生长效果，可为多粘类芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。附图说明图1为多粘类芽孢杆菌发酵生长曲线图。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分实验背景情况简要说明如下。培养基：营养琼脂培养基（NutrientAgar.NA）：蛋白胨10.00g，牛肉提取物3.00g，氯化钠5.00g，琼脂15.00g，蒸馏水1.00L，pH7.0；牛肉浸汁培养基（Bee4.3extractAgar）：取去脂肪的瘦肉500.00g，切碎，于烧杯中加蒸馏水1.00L，置4℃冰箱中过夜，用棉花过滤，将滤液于水浴中煮沸1h，使蛋白质凝固，过滤，在滤液中加入10.00g蛋白胨和5.00g氯化钠，调pH7.4，并将液体补足1.00L，琼脂15.00g，分装后灭菌，备用；多粘类芽孢杆菌活力测定方法采用稀释倒平板法，按10倍稀释法制成不同浓度稀释液，从稀释液中分别吸取一定体积置于无菌培养皿中，每一稀释度做3次重复；随后将事先融化并冷却至50℃左右的营养琼脂培养基，向每个培养皿中倒入约12mL，摇匀，待凝固后，倒置培养24h，进行菌落计数；对培养后的每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色，进行显微镜识别；选择适宜的稀释度、菌落在30～300个之间的平板进行计数；结果计算方法：。实施例1本实施例就本申请所提供的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株诱变筛选获得过程简要介绍如下。本申请所提供的多粘类芽孢杆菌YSD7主要是通过对现有出发菌株多粘类芽孢杆菌YSD5的紫外线诱变和硫酸二乙酯(DES)诱变筛选获得的，具体诱变、筛选过程简要说明如下。（1）紫外线诱变首先是对出发菌株YSD5进行紫外线诱变育种，其主要过程为：取30℃培养至对手生长期的YSD5菌悬液4ml，采用15W紫外线灯在28cm距离处照射，照射过程中，随着紫外线照射时间的延长，菌株存活率逐渐降低。辐射诱变过程中，以辐照40s时长作为紫外线诱变剂量（测定结果表明，当照射时间超过40s时，存活率低于10%，因此选择此时长作为最佳时长）。经过多轮辐照、初筛、复筛等诱变筛选后，获得一株具有较高活力突变菌株，将其命名为YSD5-189。测定结果表明，其发酵活力为57亿/mL。（2）硫酸二乙酯(DES)诱变以紫外诱变获得的YSD5-189菌株作为硫酸二乙酯诱变的出发菌株，具体诱变、筛选过程为：将活化后的出发菌株YSD5-189接种到盛有100mL牛肉膏蛋白胨的250mL三角瓶中，30℃、180r/min振荡培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产多粘类芽孢杆菌，其特征在于，该菌株名称为：多粘类芽孢杆菌YSD7，该菌株已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC 19087。/n

【技术特征摘要】
1.一株高产多粘类芽孢杆菌，其特征在于，该菌株名称为：多粘类芽孢杆菌YSD7，该菌株已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC19087。


2.利用权利要求1所述高产多粘类芽孢杆菌所制备发酵产物，其特征在于，通过如下步骤制备获得：
（1）菌株活化和制备种子液
将所保存的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株活化后，接种至种子培养基中发酵制备种子液；
（2）制备发酵液
将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，28~35℃、180-200rpm发酵制备发酵液。


3.如权利要求2所述发酵产物，其特征在于，步骤（1）中，质量百分比计，所述种子培养基为：葡萄糖2%，玉米粉3％，豆饼粉5％，玉米浆干粉1%，磷酸二氢钾0.2％，酵母粉1.5%，pH7.0。


4.如权利要求2所述发酵产物，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙利鹏，焦国宝，管宁，崔怡，梁颖杰，崔红建，郭蒙恩，朱飞帆，
申请(专利权)人：河南新仰韶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41