一株产漆酶突变菌血红栓菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一株产漆酶突变菌血红栓菌及其应用专利申请。血红栓菌YSQ8菌株已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 19142。本申请中，发明专利技术人在现有两株不同表型的血红栓菌（YSQ6‑105、YSQ7）基础上，通过对其进行紫外诱变和原生质体融合基础上，进一步通过定向筛选，最后获得了一株具有较高发酵酶活的血红栓菌YSQ8菌株。初步实验结果表明，YSQ8菌株相较于原始出发菌株，其发酵酶活可提高27倍左右，表现出较好应用前景。

A laccase producing mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
一株产漆酶突变菌血红栓菌及其应用
本专利技术属于生物发酵工程
，具体涉及一株产漆酶突变菌血红栓菌及其应用专利申请。
技术介绍
漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，能够催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使之生成相应的醌和水。漆酶首次被日本学者Yoshida从日本紫胶漆树（Rhusvernicifera）中发现，随即在1894年被Bertrand命名为含金属的氧化酶。在1986年，Bertrand和Laborde等发现这种酶也存在于高等真菌中。漆酶的来源广泛，根据来源分为漆树漆酶和真菌漆酶两大类，真菌漆酶的催化性能强，具有降解木质素、酚类物质的作用，所以在纺织、造纸、食品、饲料、环保等方面具有较好的市场前景和极高的应用价值。但是市场上实际漆酶产品并不多见，或者价格比较高昂，其主要原因在于从植物中提取获得漆酶受树种生长速度和生长量的制约，而从真菌中提取时，受限于真菌发酵产量偏低制约，因而限制了漆酶在各个领域中的应用。
技术实现思路
基于现有漆酶发酵菌株血红栓菌基础上，专利技术人通过多轮原生质体电融合育种和定向选育，获得了一株具有较高产量的血红栓菌菌株，从而为相关生物酶的产业化生产奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一株产漆酶突变菌血红栓菌，其名称为：血红栓菌（Pycnoporussanguineus）YSQ8，该菌株已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC19142。该菌株是通过对现有血红栓菌YSQ6-105和血红栓菌YSQ7经紫外诱变、和多轮原生质体电融合育种选育基础上获得的。利用所述产漆酶突变菌血红栓菌所制备漆酶，通过如下步骤制备获得：（1）菌株活化和制备种子液将所保存的血红栓菌YSQ8菌株在PDA培养基中，30℃活化培养后，转接于种子培养罐中，28-32℃、160-180rpm发酵制备种子液；（2）制备发酵液按照10%体积比接种量，将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵罐的发酵培养基中，在发酵罐内，28-32℃，160-180rpm发酵，发酵过程中，可在发酵至100h左右补料发酵，最终发酵至10d左右，当菌丝体自溶严重，酶活力无明显升高时即可放罐结束发酵，从而获得发酵液；以质量体积百分比计，所述发酵培养基，包括：葡萄糖2-3%，玉米粉4-6%，玉米浆1-3%，豆饼粉3-5%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，硫酸铜0.01-0.03%，硫酸锌0.01-0.03%，pH4.0-5.0；补料操作时，以质量体积百分比计，所补营养物为：玉米淀粉25-30%，玉米浆2-4%，pH4.0-5.0；（3）提取漆酶对步骤（2）中发酵液进行絮凝沉淀、过滤、浓缩等操作可制备漆酶成品酶液态制剂或者直接进行干燥处理获得漆酶固态成品制剂；液态漆酶成品制剂，具体可参考如下操作进行制备：在步骤（2）的发酵醪液中加入终浓度为120ppm聚丙烯酰胺（作为絮凝剂）和3.5%质量份数珍珠岩（作为助滤剂）进行絮凝，然后进行板框压滤；对滤液进行超滤浓缩后，加入防腐剂和保护剂（防腐剂如：苯甲酸钠2‰、保护剂如：NaCl9‰）配兑后用硅藻土进行精制以过滤除菌，最终得到液态漆酶成品酶制剂；固态漆酶成品制剂，可参考如下操作：将步骤（2）的发酵醪液直接转入乳化罐中，进行喷雾干燥处理，将所得干燥原粉加入稀释剂经标准化处理后，即可制备获得固态漆酶成品制剂。本申请中，专利技术人在现有两株不同表型的血红栓菌（血红栓菌YSQ6是专利技术人早期从韶山工厂附近腐烂林木中筛选所得菌株，也是申请人现有生产应用菌株，其发酵产酶水平最高约为1029u/mL左右；而血红栓菌YSQ6-105是由血红栓菌YSQ6经紫外诱变后筛选的高产菌株，该菌株表型特征为：平板菌落蓬松呈白色，产孢子，镜检为中间有隔膜的菌丝片段；血红栓菌YSQ7则是由血红栓菌YSQ6在发酵培养过程中自然选育的高产菌株，菌株表型特征为：平板菌落致密呈白色，产孢子，镜检为中间有隔膜的菌丝片段）基础上，通过对其进行紫外诱变、和原生质体融合基础上，进一步通过定向筛选，最后获得了一株具有较高发酵酶活的血红栓菌YSQ8菌株。初步实验结果表明，YSQ8菌株相较于原始出发菌株，其发酵酶活可提高27倍左右，表现出较好应用前景。基于此，可为降低纺织、造纸、食品、饲料、环保等行业的漆酶应用成本奠定良好技术基础。附图说明图1为多粘类芽孢杆菌发酵生长曲线图。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分实验背景情况简要说明如下。实验试剂：10mmol/L的2,6-二甲氧基酚（DMP）、0.1mol/L的柠檬酸磷酸缓冲液（pH3.5），常规配制；但需要注意的是，配制好2,6-二甲氧基酚（DMP）溶液后，需要棕色瓶中冰箱中保存一星期后再用，保存期1个月，若吸取出来有颜色变化说明底物已被氧化，不可再用漆酶酶活力的测定（DMP法）酶活的定义为：在一定温度、pH条件下，1min内氧化产生1μmol产物所需要的酶量为一个酶活单位；由于漆酶能氧化底物2,6-二甲氧基酚（DMP）成2,6-二甲氧基酚醌，该物质在470nm波长下有最大吸收波长（49600L▪mol-1▪cm-1），由此在一定浓度范围内该物质的光吸收值与该物质的浓度成正比；因此可以根据每分钟光度变化值换算出产生的产物浓度，再根据酶活定义计算出酶活力。具体测定步骤为：将样品发酵液8000rpm离心5min，取上清液；打开水浴锅，温度设置为60℃，取几支10mL试管，分别加入2.4mL柠檬酸-磷酸缓冲液（pH3.5）、0.5mLDMP溶液，水浴保温5min；取0.1mL上清液（或稀释液）加入至上述保温试管反应体系中，稍许摇晃立即倒入比色皿中测定吸光度，同时秒表计时开始，读取记录0s时吸光度值OD0s；待反应1min时读取记录反应1min时的吸光度值OD60s；酶活力计算；式中：OD60S为反应1min时的吸光度值，OD0S为开始反应0s时吸光度值，7.258为计算系数，n为稀释倍数。实施例1本实施例就本申请所提供的血红栓菌YSQ8菌株诱变、选育获得过程简要介绍如下。本申请所提供的血红栓菌YSQ8菌株是以现有两株不同表型的血红栓菌（YSQ6-105、YSQ7）为基础，通过质体融合和定向选育方式获得，具体过程简要介绍如下。（1）制备原生质体取所保存的两株出发菌株（YSQ6-105、YSQ7）菌体，用0.6M山梨醇渗透压稳定剂(0.1M柠檬酸缓冲+0.6M山梨醇+0.01MEDTA)悬浮，置冰中备用；然后加入溶菌酶1.2%、蜗牛酶0.8%、纤维素酶0.8%，30℃条件下酶解6小时，制得原生质体备用；制备过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株产漆酶突变菌血红栓菌，其特征在于，该菌株名称为：血红栓菌YSQ8，该菌株已于 2019 年 12 月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC 19142。/n

【技术特征摘要】
1.一株产漆酶突变菌血红栓菌，其特征在于，该菌株名称为：血红栓菌YSQ8，该菌株已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC19142。


2.利用权利要求1所述产漆酶突变菌血红栓菌的漆酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌株活化和制备种子液
将所保存的血红栓菌YSQ8菌株活化培养后，发酵制备种子液；
（2）制备发酵液
将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵罐的发酵培养基中，发酵制备获得发酵液；
（3）提取漆酶
对步骤（2）中发酵液进行絮凝沉淀、过滤、浓缩操作可制备漆酶成品酶液态制剂或者直接进行干燥处理获得漆酶固态成品制剂。


3.如权利要求2所述漆酶制备方法，其特征在于，步骤（1）中，制备种子液时，发酵条件为：28-32℃、160-180rpm。


4.如权利要求2所述漆酶制备方法，其特征在于，步骤（2）中，制备发酵液时，接种种子...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙利鹏，管宁，焦国宝，陈晓宇，梁颖杰，卢佳琪，邹瑞瑞，
申请(专利权)人：河南新仰韶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41