重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺、CA16病毒疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺、CA16病毒疫苗及其制备方法。包括以下步骤：将破碎后的菌体悬液用0.45um‑0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05‑0.2L/min/m

Crude purification of CA16 virus like particles expressed by recombinant Hanson's yeast, CA16 virus vaccine and its preparation

【技术实现步骤摘要】
重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺、CA16病毒疫苗及其制备方法
本专利技术涉及生物制品领域，尤其涉及一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺、CA16病毒疫苗及其制备方法。
技术介绍
病毒样颗粒疫苗的出现为研发新型安全有效的疫苗提供了一个新的契机。对于柯萨奇病毒A16型(CA16)疫苗，将含CA16外壳蛋白P1基因和3CD蛋白酶基因的重组汉逊酵母工程菌发酵，具遗传性质稳定、操作简单、高密度发酵培养、目的产物产量高、生产成本低、适合于工业化大生产等特点，还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白翻译后加工等优势，是一种优于大肠杆菌和其它真核表达系统的较为先进的VLP疫苗表达系统。现阶段制约汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒大规模生产的因素为没有经济可行的纯化方式。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺，该工艺可显著提高抗原回收率、蛋白去除率和纯化速度，经济可行，适用于规模化生产。本专利技术进一步所要解决的技术问题是，提供一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗的制备方法，该方法可显著提高抗原回收率、蛋白去除率和纯化速度，经济可行，适用于规模化生产。本专利技术进一步所要解决的技术问题是，提供一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗，该疫苗具有显著提高的抗原回收率、蛋白去除率和纯度，适用于规模化生产。为解决上述技术问题，本专利技术公开了以下技术方案：一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺，包括以下步骤：将破碎后的菌体悬液用0.45um-0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05-0.2L/min/m2，浓缩1-2倍，用缓冲液洗滤2-5倍，获得微滤澄清液；将所述澄清液进行离子交换膜层析，得到目标蛋白液。在一些可能的实施方式中，所述离子交换膜层析具体包括：调节所述微滤澄清液至电导为2-10ms/cm；将离子交换膜柱用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；用5-10个柱体积/min的流速将调节后的所述微滤澄清液上样至离子交换膜柱，继续用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；用流速为5-10个柱体积/min缓冲液洗脱后，即获得所述目标蛋白液。在一些可能的实施方式中，在所述膜包之前，还包括以下步骤：将破碎后的菌体悬液倒入离心瓶中离心后，收集上清液。在一些可能的实施方式中，所述膜的孔径为0.45um。在一些可能的实施方式中，所述膜的孔径为0.65um。在一些可能的实施方式中，所述缓冲液包括：20-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0-10％的甘油，pH值为6.5-8.5。在一些可能的实施方式中，所述缓冲液还包括：0.05-0.35mol/L的NaCl。在一些可能的实施方式中，所述缓冲液包括：50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、5％甘油的0.15mol/L的NaCl，pH值6.5-8.5。相应地，本专利技术还公开了一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗的制备方法，包括有如上所述的粗纯工艺。相应地，本专利技术还公开了一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗，采用如上所述的制备方法制备得到。本专利技术的有益技术效果是：本专利技术的实施例通过采用0.45um-0.65微滤微滤膜包直接微滤澄清去杂，从而显著提高了抗原回收率、蛋白去除率和纯化速度。抗原回收率75％以上，杂蛋白去除率30％以上，可以代替离心步骤，设备和操作简单，为大规模生产节约大量人力和时间成本。具体实施方式下面详细描述本专利技术提供的重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺的实施例；本实施例主要包括以下步骤：将破碎后的菌体悬液用0.45um-0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05-0.2L/min/m2，浓缩1-2倍，用缓冲液洗滤2-5倍，获得微滤澄清液；将所述澄清液进行离子交换膜层析，得到目标蛋白液。在一些可能的实施方式中，所述离子交换膜层析具体包括：调节所述微滤澄清液至电导为2-10ms/cm；将离子交换膜柱用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；用5-10个柱体积/min的流速将调节后的所述微滤澄清液上样至离子交换膜柱，继续用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；用流速为5-10个柱体积/min缓冲液洗脱后，即获得所述目标蛋白液。在一些可能的实施方式中，在所述膜包之前，还包括以下步骤：将破碎后的菌体悬液倒入离心瓶中离心后，收集上清液。在一些可能的实施方式中，所述膜的孔径为0.45um。在一些可能的实施方式中，所述膜的孔径为0.65um。在一些可能的实施方式中，所述缓冲液包括：20-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和0-10％的甘油，pH值为6.5-8.5。在一些可能的实施方式中，所述缓冲液还包括：0.05-0.35mol/L的NaCl。在一些可能的实施方式中，所述缓冲液包括：50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、5％甘油的0.15mol/L的NaCl，pH值6.5-8.5。本专利技术实施例提供的一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗的制备方法，包括有前述所述的粗纯工艺，其余与现有技术相同，不再一一赘述。本专利技术实施例提供的一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒疫苗，采用前述实施例所述的制备方法制备得到，不再一一赘述。为了更进一步阐释本实施例为达成预定专利技术目的所采取的的技术手段和效果，对本实施例重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。实施例1：微滤+膜层析步骤1：将工程菌采用破碎缓冲液重悬，在压力1350bar的条件下破碎细胞2次；所述破碎缓冲液(20-50mMTris，0.2-1MNaCl，0-10％甘油，2mMEDTA-Na2，2mMPMSF，pH7.5-8.5)；步骤2：将步骤1破碎后的菌体悬液用0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05-0.2L/min/m2，浓缩1-2倍，用缓冲液洗滤2-5倍获得微滤澄清液。所述洗滤缓冲液(20-50mMTris，0-10％甘油，pH值6.5-8.5)。采用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5)的缓冲液调节微滤澄清液至样品电导为2-10ms/cm；将离子交换膜柱用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min；用5-10个柱体积/min将调节后的样品上样至离子交换膜柱上；继续用20-50mm三羟甲基氨基甲烷(含0-10％甘油，pH(6.5-8.5)的缓冲液平衡5-10个柱体积，流速5-10个柱体积/min；...

【技术保护点】
1.一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺，其特征在于，包括以下步骤：/n将破碎后的菌体悬液用0.45um-0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05-0.2L/min/m

【技术特征摘要】
1.一种重组汉逊酵母表达的CA16病毒样颗粒的粗纯工艺，其特征在于，包括以下步骤：
将破碎后的菌体悬液用0.45um-0.65um孔径的膜包，控制透过流速为0.05-0.2L/min/m2，浓缩1-2倍，用缓冲液洗滤2-5倍，获得微滤澄清液；
将所述澄清液进行离子交换膜层析，得到目标蛋白液。


2.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述离子交换膜层析包括：
调节所述微滤澄清液至电导为2-10ms/cm；
将离子交换膜柱用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；
用5-10个柱体积/min的流速将调节后的所述微滤澄清液上样至离子交换膜柱，继续用流速为5-10个柱体积/min的缓冲液平衡5-10个柱体积；
用流速为5-10个柱体积/min缓冲液洗脱后，即获得所述目标蛋白液。


3.如权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，在所述膜包之前，还包括以下步骤：
将破碎后的菌体悬液倒入离心瓶中离心后，收集上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐敏，郭靖，李进，祝孟杰，刘鹏，李海欧，刘海涛，
申请(专利权)人：深圳康泰生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44