一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途，所述重组间充质干细胞由趋化因子基因修饰间充质干细胞得到，其能够将无免疫源性的肿瘤转化为有免疫源性的肿瘤，同时能够与PD1抗体联用抑制实体肿瘤的增殖，显著增加瘤内浸润淋巴细胞的含量。本发明专利技术提供的重组间充质干细胞的制备方法，操作简单，条件易控，成本低廉，适合大规模应用。

A recombinant mesenchymal stem cell and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途
本专利技术属于基因工程
，具体涉及干细胞
，尤其涉及一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途。
技术介绍
免疫治疗已成为继靶向治疗后，肿瘤治疗领域的重要进展。特别是对于没有靶向驱动基因变异及治疗靶点的患者，免疫治疗的出现给他们带来了新的希望。同时，临床研究表明，肿瘤患者一旦响应免疫治疗，往往能带来长期的获益，甚至是疾病的完全缓解。目前，已有多个PD-1/PD-L1抑制剂(如纳武利尤单抗和阿特珠单抗等)，共获批用于非小细胞肺癌、尿路上皮癌等12种实体瘤和所有微卫星高不稳定性(MSI-H)实体瘤的二/三线甚至一线治疗，但目前没有高效的单一针对PD-1/PD-L1抑制剂疗效预测的分子标志物。FDA批准用于指导免疫治疗患者筛查的生物标记物中，PD-L1表达阳性患者的免疫治疗有效率仍然很低。同时，虽然肿瘤突变负荷(TMB)是一种预测PD-1/PD-L1抑制剂治疗的重要标志物，但高TMB(TMB-H)患者的客观缓解率也仅有约30％。TMB联合PD-L1预测PD-1/PD-L1抑制剂效果也并不理想。PD-L1蛋白表达反映的是肿瘤组织中潜在的PD-1/PD-L1药物作用靶点，而MSI-H和TMB-H一定程度上能反映患者肿瘤新抗原的数量。PD-L1表达阳性和TMB-H的患者响应PD-1/PD-L1抑制剂仍不理想的原因可能和肿瘤的免疫微环境有关，当中最重要的是肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的状态相关，只有在有浸润淋巴细胞存在的情况下，新抗原才能体现出免疫源性。相关研究根据TILs的存在与否，将肿瘤分为所谓的“冷肿瘤”和“热肿瘤”，即，热肿瘤是有浸润淋巴细胞的肿瘤，而冷肿瘤则相反，“热”和“冷”反映的是肿瘤是否有免疫源性。冷肿瘤的PD-1/PD-L1抑制剂的有效率较低，而热肿瘤中PD-L1高表达的肿瘤则更有可能响应PD-1/PD-L1治疗，患者也可能有更多的肿瘤新抗原。然而，在热肿瘤中PD-L1高表达的不同患者中，TILs的细胞类型和功能状态也不相同。同一患者不同时间TILs也并不是一成不变的，TILs的mRNA和蛋白表达会受疾病治疗等的影响，肿瘤免疫微环境的异质性影响了不同患者对免疫治疗的响应。例如：研究分析TILs不同类型细胞对免疫治疗的影响，CD3+和CD8+TILs与非小细胞肺癌、黑色素瘤等实体瘤更好的临床获益相关，然而只有CD8是一个独立的预后因素，而FOXP3+调节性T细胞等与免疫获益负相关；临床研究证实PD-L1表达阳性的TILs响应阿特珠单抗治疗。同时，TILs细胞类型、T细胞受体的克隆变化、肿瘤放化疗后的新抗原变化等都能反映免疫微环境动态变化的一部分，这些都能反映肿瘤对免疫治疗的响应。免疫微环境的变化，可能会使原本并不响应免疫治疗的患者，变为响应治疗。但是，现有技术中无法高效改变免疫微环境，即无法高效实现“冷”“热”肿瘤的转化，使得PD1抗体在应用于实体瘤的治疗时存在应用限制，同时无法扩展免疫治疗应用范围及提高免疫治疗有效率。因此，有必要提供一种重组间充质干细胞及其制备方法和应用，该重组间充质干细胞能够使肿瘤具有免疫源性，且能够对实体瘤实现有效治疗。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术人进行了锐意研究，利用具有趋化肿瘤杀伤细胞的趋化因子来修饰间充质干细胞，使得趋化因子在间充质干细胞中过表达，同时优化了制备过程中的病毒包装、转导等步骤，使得制备的重组间充质干细胞在肿瘤局部能够形成高浓度的趋化因子，实现无免疫源性的冷肿瘤能够转化为有免疫源性的热肿瘤，同时能够与PD1抗体联用抑制实体肿瘤的增殖，从而完成了本专利技术。具体来说，本专利技术的目的在于提供以下方面：第一方面，提供一种重组间充质干细胞，其中，所述重组间充质干细胞由趋化因子基因修饰间充质干细胞得到。第二方面，提供一种第一方面所述的重组间充质干细胞的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：步骤1，获取用于修饰间充质干细胞的基因及包含该基因的重组质粒；步骤2，制备携带上述基因的重组病毒；步骤3，制备得到重组间充质干细胞。第三方面，提供一种第二方面所述的方法制备的重组间充质干细胞。第四方面，提供一种第一方面所述的重组间充质干细胞或第三方面所述的重组间充质干细胞在制备治疗肿瘤药物中的用途。本专利技术所具有的有益效果包括：(1)本专利技术所提供的重组间充质干细胞，能够在肿瘤局部形成高浓度的趋化因子，将冷肿瘤转化为肿瘤；(2)本专利技术所提供的重组间充质干细胞，结合PD1抗体的应用，能够有效抑制实体瘤的增殖，显著增加瘤内浸润淋巴细胞的含量；(3)本专利技术提供的重组间充质干细胞，能够同时利用间充质干细胞的持久存活、归巢到肿瘤部位的特性以及趋化因子趋化肿瘤杀伤细胞的功能，能够改变患者的免疫微环境使之响应免疫治疗，扩展免疫治疗应用范围、提高免疫治疗有效率；(4)本专利技术提供的重组间充质干细胞的制备方法，操作简单，条件易控，成本低廉，适合大规模应用。附图说明图1示出本专利技术实施例1中获得的重组质粒的结构示意图；图2示出实验例1中所述间充质干细胞Lptn和CCL4因子的分泌量的比较示意图；图3示出实验例2中各组治疗药物对黑色素瘤的抑制效果；图4示出实验例2中黑色素瘤的体积随着药物治疗的变化效果；图5示出实验例3中不同治疗药物对肿瘤内部浸润淋巴细胞含量的影响；图6示出实验例3中采用不同治疗药物后小鼠脾脏外周淋巴细胞的含量变化。具体实施方式下面通过优选实施方式和实施例对本专利技术进一步详细说明。通过这些说明，本专利技术的特点和优点将变得更为清楚明确。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本专利技术人研究发现，放疗后，肿瘤会产生更多的突变以及肿瘤新抗原，经伊匹单抗治疗耐药后，TILs增多(CD8、CD4表达上升)的肿瘤更容易响应抗PD-1/PD-L1治疗。即多线治疗后，可能会有部分“冷”肿瘤(无免疫源性的肿瘤)转化为了“热”肿瘤(有免疫源性的肿瘤)。而对于无免疫源性的肿瘤，肿瘤组织中没有货，只有很少的免疫细胞，对此类肿瘤进行免疫治疗的疗效是不佳的，需要联合一些其他治疗来让肿瘤组织中聚集免疫细胞。因此，本专利技术的第一方面提供了一种重组间充质干细胞，所述重组间充质干细胞由趋化因子基因修饰间充质干细胞得到，其能够将无免疫源性的肿瘤转化为有免疫源性的肿瘤。其中，所述间充质干细胞(MSC)是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。其具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；同时，间充质干细胞来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性，能够在肿瘤局部持续高表达趋化因子。根据本专利技术一种优选的实施方式，所述间充质干细胞为脐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组间充质干细胞，其特征在于，所述重组间充质干细胞由趋化因子基因修饰间充质干细胞得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组间充质干细胞，其特征在于，所述重组间充质干细胞由趋化因子基因修饰间充质干细胞得到。


2.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于，
所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；
所述趋化因子选自T细胞趋化因子、NK细胞趋化因子、巨噬细胞趋化因子中的一种或多种。


3.根据权利要求2所述的重组间充质干细胞，其特征在于，所述趋化因子选自CCL1-28、CXCL1-17、XCL1(Lptn)、XCL2、CX3CL1中的一种或多种；
优选地，所述趋化因子为CCL4和Lptn。


4.一种权利要求1至3之一所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，获取用于修饰间充质干细胞的基因及包含该基因的重组质粒；
步骤2，制备携带上述基因的重组病毒；
步骤3，制备得到重组间充质干细胞。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤1中，所述用于修饰间充质干细胞的基因为趋化因子融合基因，
所述步骤1包括以下子步骤：
步骤1-1，获取融合基因的各个基因片段，进行连接，获得融合基因；
步骤1-2，将融合基因和载体质粒均进行双酶切，并回收酶切产物；
步骤1-3，将酶切产物经过连接、转化、...

【专利技术属性】
技术研发人员：段海峰，薛冰华，于婷婷，肖秀孝，解晶，庞如梦，张群伟，弓景波，
申请(专利权)人：北京双因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11