可诱导分泌抗CD47抗体的工程化免疫细胞制造技术

提供了一种在CAR和/或外源TCR被激活时可诱导分泌抗CD47抗体的免疫细胞及其用途、含有所述免疫细胞的制剂，还提供了所述免疫细胞的制备方法以及用于所述制备方法的试剂盒。

Engineering immune cells that can induce the secretion of anti-CD47 antibody

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可诱导分泌抗CD47抗体的工程化免疫细胞
本专利技术属于肿瘤免疫细胞治疗领域，具体地，涉及一种可诱导分泌抗CD47抗体的工程化免疫细胞。
技术介绍
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。近年来，嵌合抗原受体基因修饰T(CAR-T)细胞作为“活的药物”在血液肿瘤治疗中取得了令人振奋的效果，成为肿瘤治疗新的发展方向。CAR的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CAR在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CAR相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CAR基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CAR。现在血液肿瘤的临床试验中应用最多的是第二代CAR。CAR-T细胞在血液系统恶性肿瘤的治疗中显示出前所未有的疗效，如对晚期复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解(CR)可达到90％，对慢性淋巴细白血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50％以上。虽然CAR-T在治疗白血病和淋巴瘤上潜力很大，但在治疗很多实体瘤和一些血液瘤上效果欠佳。目前CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗过程中尚存在脱靶效应、毒副作用、体内持续时间短、复发率高等问题。CAR-T细胞在治疗实体瘤方面，其安全性和有效性述已得到证实，但疗效还有待提高。CD47是治疗肿瘤的一个潜在靶点，目前研究主要集中在使用靶向CD47的抗体来进行肿瘤治疗。但是，由于CD47普遍表达于正常组织中，全身性的输注抗体会带来很多的脱靶毒副作用，比如贫血、神经毒性等。因此较少使用靶向CD47的抗体来治疗表达CD47的肿瘤。综上所述，本领域仍然需要进一步的研究，开发一种能更有效、特异性好、副作用小地治疗肿瘤的工程化免疫细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能更有效、特异性好、副作用小地治疗肿瘤的工程化免疫细胞(如CAR-T细胞)。本专利技术的又一目的是提供一种可诱导分泌抗CD47抗体的工程化免疫细胞(如CAR-T细胞)及其制法和应用。本专利技术的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞细胞具有以下特征：(a)所述免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR或外源TCR，所述CAR靶向肿瘤细胞的标志物，所述外源TCR靶向肿瘤细胞的标志物；和(b)当所述CAR被激活和/或所述外源TCR被激活时，所述免疫细胞诱导分泌抗CD47抗体。在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞选自下组：(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。在另一优选例中，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞具有以下特征：(a)所述细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR靶向肿瘤细胞的标志物；和(b)当所述CAR被激活时，所述CAR-T细胞诱导分泌抗CD47抗体。在另一优选例中，所述抗CD47抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。在另一优选例中，所述抗CD47抗体是部分或全人源化的抗体。在另一优选例中，所述的抗CD47抗体为单链或双链形式。在另一优选例中，所述的抗CD47抗体包括串联的多个(2、3、或4个)单链抗体。在另一优选例中，在串联的多个(2、3、或4个)单链抗体中，设有位于两个相邻的单链抗体之间单链抗体间的连接肽La。在另一优选例中，所述连接肽La的长度为5-25，较佳地10-20个氨基酸。在另一优选例中，所述的连接肽为柔性的。在另一优选例中，所述“激活”指所述CAR或外源TCR与肿瘤细胞的标志物结合。在另一优选例中，所述“肿瘤的标志物”指肿瘤的特异性抗原。在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体CAR或外源TCR定位于所述工程化免疫细胞的细胞膜。在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体CAR定位于所述CAR-T细胞的细胞膜。在另一优选例中，所述CAR的结构如式I所示：L1-scFv-H1-TM-C-CD3ζ (I)式中，L1为无或信号肽序列；scFv为抗原结合结构域；H1为无或铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；所述“-”连接肽或肽键。在另一优选例中，所述L1分别选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。优选地L的序列如SEQ ID NO.:1的第1-22位所示。在另一优选例中，所述scFv为靶向肿瘤抗原的抗体单链可变区序列。在另一优选例中，所述scFv为靶向选自下组抗原的抗体单链可变区序列：CD19、CD20、CD22、CD123、CD47、CD138、CD33、CD30、间皮素(mesothelin,MSLN)、EGFR、GPC3、BCMA、ErbB2、NKG2D配体(ligands)、LMP1、EpCAM、VEGFR-1、Lewis-Y、ROR1、Claudin18.2、或其组合。在另一优选例中，所述scFv为靶向CD19的抗体单链可变区序列。在另一优选例中，所述scFv为FMC63，序列如SEQ ID NO.:1第23-270位所示。在另一优选例中，所述scFv为靶向或MSLN的抗体单链可变区序列。在另一优选例中，所述scFv为P4，序列如SEQ ID NO.:5中第22-279位所示。在另一优选例中，所述H选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述的H1为CD28来源的铰链区，优选地H1的序列如SEQ ID NO.:1的第271-309位所示。在另一优选例中，所述TM选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。在另一优选例中，所述TM为CD28来源的跨膜区，优选地TM的序列如SEQ ID NO.:1的第310-336位所示。在另一优选例中，所述C选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞细胞具有以下特征：/n(a)所述免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR或外源TCR，所述CAR靶向肿瘤细胞的标志物，所述外源TCR靶向肿瘤细胞的标志物；和/n(b)当所述CAR被激活和/或所述外源TCR被激活时，所述免疫细胞诱导分泌抗CD47抗体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170927 CN 201710891841X一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞细胞具有以下特征：
(a)所述免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR或外源TCR，所述CAR靶向肿瘤细胞的标志物，所述外源TCR靶向肿瘤细胞的标志物；和
(b)当所述CAR被激活和/或所述外源TCR被激活时，所述免疫细胞诱导分泌抗CD47抗体。


如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述的工程化的免疫细胞选自下组：
(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；
(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或
(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。


如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述CAR的结构如式I所示：
L1-scFv-H1-TM-C-CD3ζ (I)
式中，
L1为无或信号肽序列；
scFv为抗原结合结构域；
H1为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
所述“-”连接肽或肽键。


如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述抗CD47抗体为抗CD47scFv，所述抗CD47scFv的结构如下式II所示：
L2-VH-X-VL-H2-G (II)
其中，
L2为无或信号肽序列；
VH为抗CD47抗体的重链可变区；
X为无或连接肽；
VL为抗CD47抗体的轻链可变区；
H2为无或免疫球蛋白的铰链区；
G为无或Fc片段。


如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述抗CD47抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。


如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述抗CD47抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永亮，刘丽萍，曹卫，马玲，马安云，何佳平，沈连军，王欣欣，
申请(专利权)人：亘喜生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31