制备过表达外源基因的细胞的方法技术

本发明专利技术涉及制备过表达外源基因的细胞的方法。本发明专利技术利用STING信号通路抑制剂，尤其是羰基氰基3‑氯苯腙，来培养培养电转细胞，尤其是电转的免疫效应细胞，能明显提高提高细胞电转后存活率及细胞总数。

The method of preparing over expressed foreign gene cells

【技术实现步骤摘要】
制备过表达外源基因的细胞的方法
本专利技术涉及电转细胞的培养，具体涉及制备过表达外源基因的细胞的方法。
技术介绍
使用表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，如CAR-T细胞的过继性细胞治疗(AdoptiveCellTherapy，ACT)用于治疗肿瘤具有永久性改变肿瘤治疗现状的潜力。这类治疗依赖于高效、稳定和安全的基因转移平台。将编码嵌合抗原受体的合成的基因转入免疫效应细胞，如T细胞内，是实现肿瘤治疗的第一步。基因转移技术主要包括病毒方法与非病毒方法。病毒方法主要包括使用逆转录病毒载体或慢病毒载体来表达CAR基因，通过包装的病毒颗粒将CAR基因导入免疫效应细胞内，并通过逆转录病毒或慢病毒自身的整合系统整合至细胞基因组上。病毒载体系统的优点在于病毒颗粒能够有效地转导免疫效应细胞，如T细胞，并且高效稳定地整合到宿主细胞基因组中。但病毒的制备生产过程成本较高，费时费力，并且为了符合临床安全标准，利用病毒系统改造的免疫效应细胞中需要表现出病毒自身无复制、低基因毒性以及低免疫源性，在回输至人体内后还需要长期监控，存在着一定的安全隐患。电转(或电穿孔)在医学的部分领域中已经是一种成熟的方法，但其在生物技术中的应用才刚刚显现。通过瞬时向细胞或组织施加一定的高电场脉冲，在细胞膜表面瞬时形成通透，进而导致带电荷的分子进入细胞。经典的电穿孔将导致细胞的跨膜运输增强，并改变电导率。这一过程在细胞膜上的效果与电转的强度、重复、持续时间和电脉冲次数有关。人工的双分子层、细胞或组织依其自身具体的属性已经能够被若干常用的电转操作程序所通透。在基于电穿孔的转基因操作中，外源DNA通过可逆的电穿孔被引入胞内，外源基因在其新的宿主细胞内表达，并随着细胞分裂而被遗传。用电转的方法结合能够诱导稳定表达转基因的非病毒基因修饰系统，如转座子系统，是病毒载体系统外的另一种修饰免疫效应细胞的有效方法。转座子系统，如SleepingBeuty或PiggyBac转座系统，包含有转座酶编码序列，其编码的转座酶识别两侧的重复序列并能高效介导整合至宿主细胞基因组。转座子系统结合电转已经具有广泛治疗应用的前景，并完成了达到临床级别的要求(KebriaeiP,HulsH,JenaB,MunsellM,JacksonR,etal.(2012)InfusingCD19-DirectedTCellstoAugmentDiseaseControlinPatientsUndergoingAutologousHematopoieticStem-CellTransplantationforAdvancedB-LymphoidMalignancies.HumanGeneTherapy23:444–450)，其在T细胞中具有较高的效率。使用转座子系统的ACT依赖于对T细胞与肿瘤浸润淋巴细胞(TumorInfiltratingLymphocyte，TIL)的电转，对此，目前市场上已经有较为成熟的商业化电转仪器及配套缓冲液(例如LonzaNucleofactor)，近期也有使用SB转座子系统通过商业化的电转体系成功地构建CAR-T细胞的方法的报道(JinZ,MaitiS,HulsH,SinghH,OlivaresS,etal.(2011)ThehyperactiveSleepingBeautytransposaseSB100XimprovesthegeneticmodificationofTcellstoexpressachimericantigenreceptor.GeneTherapy18:849–856；PengPD,CohenCJ,YangS,HsuC,JonesS,etal.(2009)EfficientnonviralSleepingBeautytransposon-basedTCRgenetransfertoperipheralbloodlymphocytesconfersantigen-specificantitumorreactivity.GeneTherapy16:1042–1049),并且该利用SB转座子体系的ACT方法已经被用于临床试验(KebriaeiP,HulsH,JenaB,MunsellM,JacksonR,etal.(2012)InfusingCD19-DirectedTCellstoAugmentDiseaseControlinPatientsUndergoingAutologousHematopoieticStem-CellTransplantationforAdvancedB-LymphoidMalignancies.HumanGeneTherapy23:444–450)。羰基氰基3-氯苯腙(carbonylcyanide3-chlorophenylhydrazone，CCCP)是一种质子载体(H+ionophore)和强效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂，促使线粒体内膜对H+产生通透性，导致线粒体内膜两侧的膜电位丧失，诱导凋亡发生。也可作用于叶绿体膜，抑制光合作用；CCCP还可抑制内质网-高尔基体(ER-Golgi)之间的蛋白转运，高亲和力结合细胞色素C氧化酶。CCCP还具有其他功能：1)在牛蛙交感神经方面的实验表明，CCCP可增强促黄体生成素释放激素的释放；2)作为一种质子导体在葡萄糖存在的情况下影响E.coli细胞活性；3)对细胞内钙水平的各种调节效应；4)抑制脂肝酶的分泌；5)部分抑制pH梯度活化的Cl-摄取以及刷状缘膜的Cl-/Cl-交换等。近期的报道还显示CCCP能够引起线粒体膜电势的耗散，并进一步抑制细胞的STING通路(D.Prantner,D.J.Perkins,W.Lai,M.S.Williams,S.Sharma,K.A.Fitzgerald,S.N.Vogel,5,6-Dimethylxanthenone-4-aceticacid(DMXAA)activatesstimulatorofinterferongene(STING)-dependentinnateimmunepathwaysandisregulatedbymitochondrialmembranepotential,J.Biol.Chem.287(2012))。与病毒载体系统相比，电转结合转座子系统具有操作简单、免疫源性和基因毒性低、安全风险低的优势，是ACT的一种重要方法。但其存在的问题也比较明显：在于瞬时高电压下容易造成细胞的过量死亡，且转染效率低，具体地与细胞类型及电转条件(包括电压、波形、脉冲时间与电转缓冲液组成)有关。特别是对于免疫效应细胞，如PBMC与TIL细胞，电转的难度相对更大，虽然目前市场上已经有较为成熟的电转仪器和配套的缓冲体系，但免疫效应细胞电转后死亡率高的问题仍然较为突出。因此目前仍需要一种能够提高免疫效应细胞电转后存活率的方法。
技术实现思路
本专利技术第一方面提供STING信号通路抑制剂在培养电转细胞中的应用。本专利技术第二方面提供一种培养电转细胞的方法，所述方法包括在含有STING信号通路抑制剂的培养基中培养电转后的细胞的步骤。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.STING信号通路抑制剂在培养电转细胞中的应用；优选地，所述STING信号通路抑制剂为羰基氰基3-氯苯腙；优选地，所述细胞为免疫效应细胞。/n

【技术特征摘要】
1.STING信号通路抑制剂在培养电转细胞中的应用；优选地，所述STING信号通路抑制剂为羰基氰基3-氯苯腙；优选地，所述细胞为免疫效应细胞。


2.一种培养电转细胞的方法，其特征在于，所述方法包括在含有STING信号通路抑制剂的培养基中培养电转后的细胞的步骤；优选地，所述STING信号通路抑制剂为羰基氰基3-氯苯腙；优选地，所述细胞为免疫效应细胞。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括，电转结束后，将电转的细胞转入培养基中培养0.5-8小时，然后在所述培养基中加入所述STING信号通路抑制剂，继续培养；优选地，加入所述STING信号通路抑制剂后，其在培养基中的终浓度在5-100μM、优选10-80μM的范围内。


4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T细胞、TIL、NK细胞、NKT细胞、CAR-T细胞、CIK细胞、TCR-T细胞和巨噬细胞中的一种或多种；优选选自T细胞、TIL和CAR-T细胞中的一种或多种。


5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基为细胞培养基，优选为用于培养免疫效应细胞的培养基；优选选自CTSTM无血清细胞培养基、DMEM培养基和RPMI1640培养基；更优选为CTSTM无血清细胞培养基。


6.一种电转法制备表达外源基因的细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)通过电转向细胞中导入含有表达外源基因的核酸；
2)用含有STING信号通路抑制剂的培养基培养步骤1)中电转...

【专利技术属性】
技术研发人员：金华君，徐飞，黄晨，刘祥箴，钱其军，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，上海细胞治疗研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31