一种多功能免疫杀伤转基因细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种多功能免疫杀伤转基因细胞，所述细胞具有细胞杀伤毒性，并且能够表达含有人恒定区的全长抗体；所述细胞为细胞免疫效应细胞，所述细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞、T细胞、细胞毒杀伤细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞中的任意一种或多种，所述含有人恒定区的全长抗体选自人鼠嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体，本发明专利技术涉及基因工程技术领域。该多功能免疫杀伤转基因细胞，能够制备多功能免疫杀伤转基因细胞，且整体制备效果好，大大的提高了整体的疗效，且临床疗效显著，保证了免疫杀伤转基因细胞用于治疗过程中的质量，整体制作步骤简单，耗费时间短，便于工作人员操作。

A multifunctional immunokilling transgenic cell

【技术实现步骤摘要】
一种多功能免疫杀伤转基因细胞
本专利技术涉及基因工程
，具体为一种多功能免疫杀伤转基因细胞。
技术介绍
基因工程又叫重组DNA技术，重组是指在体外将分离到的或合成的目的基因，通过与质粒、病毒等载体重组连接，然后将其导入不含该基因的受体细胞，使受体细胞产生新的基因产物或获得新的遗传特性，细胞免疫效应细胞主要包括细胞因子诱导的杀伤细胞，树突状细胞刺激的细胞因子诱导的杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴因子激活杀伤细胞、CD3AK细胞等，这些细胞都不表达抗体，它们直接杀灭或通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性细胞效应起作用，在趋化因子作用下，细胞免疫效应细胞可通过细胞变型主动进入肿瘤组织内部，发挥治疗作用。尽管已有不少关于这些细胞进入肿瘤及病毒治疗的临床试验的报道但是由于缺乏特异性抗体存在，其杀伤活性有限，临床疗效并不显著，现有的多功能免疫杀伤转基因细胞整体效果不好，且疗效一般。传统的多功能免疫杀伤转基因细胞，不能够制备多功能免疫杀伤转基因细胞，且整体制备效果不好，大大的降低了整体的疗效，且临床疗效不够显著，难以保证免疫杀伤转基因细胞用于治疗过程中的质量，整体制作步骤繁琐，耗费时间长，不便于工作人员操作。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种多功能免疫杀伤转基因细胞，解决了多功能免疫杀伤转基因细胞整体效果不好的问题。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种多功能免疫杀伤转基因细胞，所述细胞具有细胞杀伤毒性，并且能够表达含有人恒定区的全长抗体；所述细胞为细胞免疫效应细胞，所述细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞、T细胞、细胞毒杀伤细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞中的任意一种或多种，所述含有人恒定区的全长抗体选自人鼠嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体，并且含有人恒定区的全长抗体是通过转染病毒载体表达的，使用负载HBsAg的树突状细胞免疫1周，分离CD8+T细胞，检测HBV特异性CD8+T细胞杀伤活性，流式细胞仪技术检测免疫前后脾脏CD8+记忆性T细胞亚群比例变化，脾脏HBV特异性细胞毒性T细胞杀伤活性及IFN-γ分泌水平，RT-PCR检出HBET细胞hTERTmRNA表达，蛋白印迹法验证了HBET细胞HA的表达，端粒酶活性检测表明HBET细胞中端粒酶活性明显增高；蛋白印迹检测结果显示。优选的，所述含有人恒定区的全长抗体是通过转染非病毒载体表达的。优选的，所述抗体为抗肿瘤或抗病毒的抗体。优选的，所述RT-PCR验证HBETR-1A1细胞CYP1A，mRNA的表达，蛋白印迹结果表明HBETR-1A1细胞CYP1A1蛋白的表达是对照HBETR-V细胞的2.7倍。本专利技术还公开了一种多功能免疫杀伤转基因细胞的制备方法，具体包括以下步骤：S1、加入2ml的淋巴细胞分离液，3000xg离心20分钟，分离得到单个核细胞，以1ml的TrizoL液溶解细胞，抽提总RNA并进行逆转录，以上述引物进行扩增，得到CD14基因片段，PCR反应条件为94℃，5分钟、94℃，30秒、57℃，30秒、,72℃，50秒、共30个循环；S2、0.8％琼脂糖电泳显示扩增出目的基因片段，取PCR产物2μl克隆到pGEM-TEasyVector中；S3、将I双酶切纯化的pGEM*TEasy/CD14和pcDNA3.1(+)，0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIAquickGel切胶回收目的片段和空载体，按摩尔比3:1进行连接，连接产物转化DH5a感受态，挑取单菌落扩大培养后抽提质粒，HindM和XbaI双酶切鉴定，将重组质粒pcDNA3.1(+)/CD14纯化后转染B16pS3；S4、将含有人恒定区的全长抗体转入具有细胞杀伤毒性的细胞并表达。优选的，所述S1中20个循环结束后再次在72℃的条件下延伸7分钟。优选的，所述S4中细胞为细胞免疫效应细胞。(三)有益效果本专利技术提供了一种多功能免疫杀伤转基因细胞。具备以下有益效果：(1)、该多功能免疫杀伤转基因细胞，通过含有人恒定区的全长抗体选自人鼠嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体，并且含有人恒定区的全长抗体是通过转染病毒载体表达的，使用负载HBsAg的树突状细胞免疫1周，分离CD8+T细胞，检测HBV特异性CD8+T细胞杀伤活性，流式细胞仪技术检测免疫前后脾脏CD8+记忆性T细胞亚群比例变化，脾脏HBV特异性细胞毒性T细胞杀伤活性及IFN-γ分泌水平，RT-PCR检出HBET细胞hTERTmRNA表达，蛋白印迹法验证了HBET细胞HA的表达，端粒酶活性检测表明HBET细胞中端粒酶活性明显增高；蛋白印迹检测结果显示，能够制备多功能免疫杀伤转基因细胞，且整体制备效果好，大大的提高了整体的疗效，且临床疗效显著，保证了免疫杀伤转基因细胞用于治疗过程中的质量，整体制作步骤简单，耗费时间短。(2)、该多功能免疫杀伤转基因细胞，通过RT-PCR验证HBETR-1A1细胞CYP1A，mRNA的表达，蛋白印迹结果表明HBETR-1A1细胞CYP1A1蛋白的表达是对照HBETR-V细胞的2.7倍RT-PCR验证HBETR-1A1细胞CYP1A，mRNA的表达，蛋白印迹结果表明HBETR-1A1细胞CYP1A1蛋白的表达是对照HBETR-V细胞的2.7倍，S1、加入2ml的淋巴细胞分离液，3000xg离心20分钟，分离得到单个核细胞，以1ml的TrizoL液溶解细胞，抽提总RNA并进行逆转录，以上述引物进行扩增，得到CD14基因片段，PCR反应条件为94℃，5分钟、94℃，30秒、57℃，30秒、,72℃，50秒、共30个循环；便于工作人员操作。附图说明图1为本专利技术载体的表格图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1，本专利技术实施例提供一种技术方案：一种多功能免疫杀伤转基因细胞，细胞具有细胞杀伤毒性，并且能够表达含有人恒定区的全长抗体；细胞为细胞免疫效应细胞，细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞、T细胞、细胞毒杀伤细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞中的任意一种或多种，含有人恒定区的全长抗体选自人鼠嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体，并且含有人恒定区的全长抗体是通过转染病毒载体表达的，使用负载HBsAg的树突状细胞免疫1周，分离CD8+T细胞，检测HBV特异性CD8+T细胞杀伤活性，流式细胞仪技术检测免疫前后脾脏CD8+记忆性T细胞亚群比例变化，脾脏HBV特异性细胞毒性T细胞杀伤活性及IFN-γ分泌水平，RT-PCR检出HBET细胞hTERTmRNA表达，蛋白印迹法验证了HBET细胞HA的表达，端粒酶活性检测表明HBET细胞中端粒酶活性明显增高；蛋白印迹检测结果显示。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：所述细胞具有细胞杀伤毒性，并且能够表达含有人恒定区的全长抗体；所述细胞为细胞免疫效应细胞，所述细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞、T细胞、细胞毒杀伤细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞中的任意一种或多种，所述含有人恒定区的全长抗体选自人鼠嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体，并且含有人恒定区的全长抗体是通过转染病毒载体表达的，使用负载HBsAg的树突状细胞免疫1周，分离CD8+T细胞，检测HBV特异性CD8+T细胞杀伤活性，流式细胞仪技术检测免疫前后脾脏CD8+记忆性T细胞亚群比例变化，脾脏HBV特异性细胞毒性T细胞杀伤活性及IFN-γ分泌水平，RT-PCR检出HBET细胞hTERT mRNA表达，蛋白印迹法验证了HBET细胞HA的表达，端粒酶活性检测表明HBET细胞中端粒酶活性明显增高；蛋白印迹检测结果显示。/n

【技术特征摘要】
1.一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：所述细胞具有细胞杀伤毒性，并且能够表达含有人恒定区的全长抗体；所述细胞为细胞免疫效应细胞，所述细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞、T细胞、细胞毒杀伤细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞中的任意一种或多种，所述含有人恒定区的全长抗体选自人鼠嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体，并且含有人恒定区的全长抗体是通过转染病毒载体表达的，使用负载HBsAg的树突状细胞免疫1周，分离CD8+T细胞，检测HBV特异性CD8+T细胞杀伤活性，流式细胞仪技术检测免疫前后脾脏CD8+记忆性T细胞亚群比例变化，脾脏HBV特异性细胞毒性T细胞杀伤活性及IFN-γ分泌水平，RT-PCR检出HBET细胞hTERTmRNA表达，蛋白印迹法验证了HBET细胞HA的表达，端粒酶活性检测表明HBET细胞中端粒酶活性明显增高；蛋白印迹检测结果显示。


2.根据权利要求1所述的一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：所述含有人恒定区的全长抗体是通过转染非病毒载体表达的。


3.根据权利要求1所述的一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：所述抗体为抗肿瘤或抗病毒的抗体。


4.根据权利要求1所述的一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：所述RT-PCR验证HBETR-1A1细胞CYP1A，mRNA的表达，蛋白印迹结果表明HBETR-1A1细胞CYP1A1蛋白的表达是对照HBETR-V细...

【专利技术属性】
技术研发人员：应巧红，
申请(专利权)人：南京平港生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32