诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用技术

本发明专利技术涉及诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用。本发明专利技术揭示了利用不同转录因子组合在体外诱导星形胶质细胞直接重编程产生有功能的五羟色胺能神经元的方法，将得到的这些神经元移植到脑内能够存活。在应用转录因子的基础上加入化学小分子可以进一步提高产生五羟色胺能神经元的效率和成熟程度。利用本发明专利技术的方法产生的五羟色胺能神经元，可以用于神经再生，以及多种神经系统疾病的模拟和药物筛选。

Method and application of inducing astrocytes to transdifferentiate into serotonin neurons

【技术实现步骤摘要】
诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用
本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用。
技术介绍
五羟色胺能神经元作为一类调制神经元，通过释放神经递质五羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)，作用到多个不同的脑区，在中枢神经系统中发挥重要的调节功能。大量的研究表明，五羟色胺(5-HT)能神经元的功能与多种行为具有相关性，疼痛感觉、性取向、睡眠及周期节律、摄食以及多种情绪行为都涉及到五羟色胺能神经系统的功能。并且，一系列精神类疾病与五羟色胺能神经元功能异常有密切的联系，包括抑郁、焦虑、强迫症、精神分裂、孤独症和药物成瘾等。五羟色胺能神经元的功能与精神疾病的关系比较流行的假说指出，在发育关键期这些五羟色胺能神经元分泌的5-HT过多或过少造成递质失衡，进而影响了中枢神经系统环路的形成，最终导致其对于精神异常敏感性增强。人为地对Sert、Tph2或Htr1a基因进行改造改变其表达水平能够在小鼠上引起非正常情绪及压力相关行为。很多与精神类疾病相关的变异影响了突触前五羟色胺信号，从而改变了全脑5-HT的水平。如Sert突变通过影响Sert蛋白的转运和活性影响5-HT能神经元，因此选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)常作为抑郁相关疾病的临床药物，增加患者脑内5-HT的递质水平。5-HT在孤独症(autismspectrumdisorder，ASD)中的作用可以通过脑成像和生物标志分子方法进行检测。成像结果显示，正常儿童在两岁时脑内5-HT合成能力处于顶峰，而同龄的孤独症儿童脑内的5-HT合成水平却检测不到。药理实验中，化合物作用到5-HT2受体或使用SSRIs可以减少ASD儿童的攻击行为和重复刻板行为，从而有效地改善社交意识增加接触。5-HT能神经元参与多种情绪行为的调节，比如焦虑和恐惧行为。恐惧相关的通路通过传入和传出杏仁核的通路传递信息，而从丘脑和皮层投射到杏仁核的通路，输入信息在杏仁核内部环路中进行处理，最后直接输出到海马、脑干、下丘脑等区域。研究表明通过光遗传和化学遗传方法激活DRN的5-HT能神经元，会引起小鼠的焦虑和恐惧行为。5-HT能够促进杏仁核相关脑区环路。另外，5-HT的输入主要是通过受体的行为进行精确调控。对焦虑的影响涉及从背侧中缝核5-HT能神经元到终纹床核(BNST)的投射。将BNST的5-HT2C受体急性暴露于SSRIs会增加腹侧被盖区VTA和下丘脑外侧区LH的抑制作用，引起厌恶行为。这就解释了为什么在抑郁症患者服用SSRIs药物早期会产生更加焦虑的症状，病情加重。与5-HT能神经元递质失衡相关的精神类疾病较多，致病原因复杂，目前的临床药物作用有限且常有副作用。因此，以细胞重编程或在体转分化技术进行细胞治疗将成为未来可能的选择。2010年Vierbuchen和同事使用三个转录因子ABM(Ascl1、Brn2、Myt1l)诱导成纤维细胞重编程产生神经元(iNs)。早期一系列的研究表明，重编程可以产生多种类型的神经元，包括谷氨酸能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元等。最近的研究也从人的成纤维细胞诱导得到五羟色胺能神经元。但是在体外诱导得到的五羟色胺能神经元是否具有正常的生理功能，能否形成神经网络仍不清楚。星形胶质细胞与神经元谱系相近，并且在全脑中广泛存在。因此，以星形胶质细胞作为起始细胞在体诱导产生功能性的五羟色胺能神经元，对于研究五羟色胺能神经元在相关疾病与神经调节系统中的作用具有潜在的意义。然而，本领域技术人员至今尚未成功地以星形胶质细胞为起始细胞，诱导产生功能性的五羟色胺能神经元。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用。在本专利技术的第一方面，提供一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：在星形胶质细胞中表达(包括重组表达或过表达)选自下组的转录因子：(a)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2，Lmx1b和Nkx2.2；或(b)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2和Lmx1b；培养该细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元。在本专利技术的第二方面，提供一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：(1)在星形胶质细胞中表达(包括重组表达或过表达)以下转录因子：Ascl1/Mash1，Gata2，以及选自Foxa2、Lmx1b和Nkx2.2中的任意两种或三种(最优选地为三种)；(2)在添加化合物的条件下诱导培养(1)的细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元；其中，所述化合物包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF，Dorsomorphin，SB431542。在一个优选例中，所述的Dorsomorphin，SB431542在诱导培养的前9±2天，较佳地前9±1天添加。在另一优选例中，所述的化合物的终浓度为：Y27632：10±5μM，较佳地10±2μM；PD0332991：1±0.5μM，较佳地1±0.2μM；神经营养因子GDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；神经营养因子BDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；Dorsomorphin：0.5±0.25μM，较佳地0.5±0.15μM；SB431542：5±2.5μM，较佳地5±1.5μM。在另一优选例中，诱导培养的培养基中，还包括：B27添加物、血清、上皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF2。较佳地，各组分的终浓度为：血清：按照体积10±5％；较佳地10±2％；上皮生长因子EGF：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；成纤维细胞生长因子FGF2：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；B27添加物：1±0.5倍量(X)。在另一优选例中，所述的细胞培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：DMEM、MEM、RPMI(如RPMI1640)、Neuronalbasal或Fischer；较佳地，所述的DMEM选自：DMEM/F12，AdvancedDMEM/F12。在本专利技术的第三方面，提供由前面任一所述的方法获得的五羟色胺能神经元培养物或从该五羟色胺能神经元培养物中分离纯化的五羟色胺能神经元。在一个优选例中，所述的五羟色胺能神经元通过在星形胶质细胞中表达前述(b)组的转录因子而获得，其具有下组的性能或特征：呈现不成熟的电生理特性；或所述的五羟色胺能神经元通过在星形胶质细胞中表达前述(a)组的转录因子而获得，其具有下组的性能或特征：呈现成熟的电生理特性，产生复杂的神经元形态和电生理特性；或所述的五羟色胺能神经元通过前述第二方面所述的方法获得，其具有下组的性能或特征：呈现成熟的电生理特性，产生复杂的神经元形态和电生理特性。在本专利技术的第四方面，提供所述的五羟色胺能神经元培养物或分离纯化的五羟色胺能神经元的用途，用于：制备预防、改善或治疗神经系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：在星形胶质细胞中表达选自下组的转录因子：(a)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2，Lmx1b和Nkx2.2；或(b)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2和Lmx1b；培养该细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：在星形胶质细胞中表达选自下组的转录因子：(a)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2，Lmx1b和Nkx2.2；或(b)Ascl1/Mash1，Gata2，Foxa2和Lmx1b；培养该细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元。


2.一种诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法，包括：
(1)在星形胶质细胞中表达以下转录因子：Ascl1/Mash1，Gata2，以及选自Foxa2、Lmx1b和Nkx2.2中的任意两种或三种；
(2)在添加化合物的条件下诱导培养(1)的细胞，从而所述星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元；其中，所述化合物包括：Y27632，PD0332991，神经营养因子GDNF，神经营养因子BDNF，Dorsomorphin，SB431542。


3.如权利要求2的方法，其特征在于，所述的Dorsomorphin，SB431542在诱导培养的前9±2天，较佳地前9±1天添加。


4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的化合物的终浓度为：
Y27632：10±5μM，较佳地10±2μM；
PD0332991：1±0.5μM，较佳地1±0.2μM；
神经营养因子GDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；
神经营养因子BDNF：20±10ng/ml，较佳地20±5ng/ml；
Dorsomorphin：0.5±0.25μM，较佳地0.5±0.15μM；
SB431542：5±2.5μM，较佳地5±1.5μM。


5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，诱导培养的培养基中，还包括：B27添加物、血清、上皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF2。


6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，各组分的终浓度为：
血清：按照体积10±5％；较佳地10±2％；
上皮生长因子EGF：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；
成纤维细胞生长因子FGF2：10±5ng/ml；较佳地10±2ng/ml；
B27添加物：1±0.5倍量。


7.如权利要求2～6任一所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养基中，以选自下组的培养基作为基础培养基：DMEM、MEM、RPMI、Neuronalbasal或Fischer；较佳地，所述的DMEM选自：DMEM/F12，AdvancedDMEM/F12。


8.由权利要求1～7任一所述的方法获得的五羟色胺能神经元培养物或从该五羟色胺能神经元培养物中分离纯化的五羟色胺能神经元。


9.如权利要求8所述的五羟色胺能神经元培养物或分离纯化的五羟色胺能神经元，其特征在于，所述的五羟色胺能神经元通过在星形胶质细胞中表达权利要求1的(b)组的转录因子而获得，其具有下组的性能或特征：呈现不成熟的电生理特性；或
所述的五羟色胺能神经元通过在星形胶质细胞中表达权利要求1的(a)组的转录因子而获得，其具有下组的性能或特征：呈现成熟的电生理特性，产生复杂的神经元形态和电生理特性；...

【专利技术属性】
技术研发人员：程乐平，韩素娥，王毅，刘月光，袁嘉成，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31