PD-L1抗体分泌的抗间皮素CAR-T细胞肿瘤免疫治疗制造技术

本发明专利技术提出了PD‑L1抗体分泌的抗间皮素CAR‑T细胞肿瘤免疫治疗，该CAR‑T细胞共表达抗PD‑L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，其中，所述抗PD‑L1融合抗体由抗PD‑L1单链抗体连接到含有氨基酸突变的IgG1Fc片段形成。该转基因淋巴细胞分泌抗PD‑L1单链抗体与IgG Fc融合抗体，具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达间皮素及PD‑L1分子的肿瘤具有显著的定向杀伤作用，且安全性高。

Immunotherapy of anti mesothelin car-t cell tumor secreted by PD-L1 antibody

【技术实现步骤摘要】
PD-L1抗体分泌的抗间皮素CAR-T细胞肿瘤免疫治疗
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及T淋巴细胞、慢病毒、转基因淋巴细胞、构建体、用于治疗癌症的治疗组合物和提高淋巴细胞活性和治疗安全性的方法。
技术介绍
间皮素(mesothelin，MSLN)是一种分化抗原，它在人类正常组织的表达仅限于的胸膜、心包膜和腹膜衬里的间皮细胞。然而，间皮素却在多种人类癌症组织中高表达，包括几乎所有的间皮瘤和胰腺癌和约70％的卵巢癌和约50％的肺腺癌以及其他癌症，例如胆管癌，胃癌，肠癌，食管癌，乳腺癌。间皮素基因编码71KDa的前体蛋白，前体蛋白继而被加工成31KDa的脱落片段和40KDa的蛋白片段，31KDa的脱落片段被称为巨核细胞促进因子(MPF)，而40KDa的蛋白片段即被称为间皮素，间皮素通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)的锚定作用固定在细胞膜上。以间皮瘤为例，间皮瘤有胸膜间皮瘤和腹膜间皮瘤之分，胸膜间皮瘤是胸膜原发肿瘤，有局限型(多为良性)和弥漫型(都是恶性)之分，其中弥漫型恶性间皮瘤是胸部预后最坏的肿瘤之一。腹膜间皮瘤是指原发于腹膜间皮细胞的肿瘤。临床表现不具有特征性，常见的症状和体征有：腹痛、腹水、腹胀及腹部包块等。恶性胸膜间皮瘤的治疗，目前仍然没有有效的根治方法。治疗方法上，有姑息性治疗、外科治疗、化学治疗及放射治疗等，一般认为对于肿瘤相对局限的I期病人，主张做根治的胸膜肺切除术。对于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期病人，根治性手术已经没有意义了，只有施行姑息性手术。事实上，多数病人到疾病明确诊断时，已处于II期以上。迅速增长的胸水常导致患者严重的呼吸困难，姑息性手术只能暂时提高这些晚期病人的生活质量，而无法根治。由此可见，开发针对间皮素高表达肿瘤的治疗方法尤为迫切。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：间皮素却在多种人类癌症组织中高表达，包括几乎所有的间皮瘤和胰腺癌和约70％的卵巢癌和约50％的肺腺癌以及其他癌症，例如胆管癌，胃癌，肠癌，食管癌，乳腺癌。因此，间皮素代表着肿瘤免疫治疗领域中一个有着巨大吸引力的靶点。但是在肿瘤的免疫治疗中，作为免疫负调节机制，激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)可以表达负调控的监管结构，即在细胞表面或细胞内表达免疫检查点分子，如程序性细胞死亡1受体(PD-1)可以表达在活化CTLs上，其与肿瘤细胞上表达的程序性死亡配体1(PD-L1)相互作用，可以抑制抗肿瘤T细胞反应。而恰恰许多肿瘤细胞，包括间皮素高表达肿瘤细胞均高表达PD-L1，PD-L1与PD-1的结合，导致CTLs增生性反应的下调，细胞因子的分泌减少和T细胞的无能或凋亡。进而导致肿瘤免疫治疗的效果大打折扣。为了解决上述问题，专利技术人提出了一种可以表达和分泌抗PD-L1抗体、表达具有识别MSLN的嵌合抗原受体以及无功能EGFR的转基因淋巴细胞，在本申请中，称之为PD-L1抗体分泌的抗间皮素CAR-T细胞。专利技术人在实验中发现，本专利技术所提出的抗间皮素CAR-T细胞可以抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，对高表达间皮素肿瘤的特异杀伤能力强，而对正常MSLN表达水平的间皮细胞没有杀伤，且本申请所提出的抗间皮素CAR-T细胞可表达无功能EGFR，显著增加了该CAR-T细胞治疗的安全性。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种T淋巴细胞。根据本专利技术的实施例，所述T淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别肿瘤抗原间皮素；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，所述跨膜区包括CD8的跨膜段，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括4-1BB的胞内段以及CD3ζ链；所述抗PD-L1融合抗体包括：PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L突变。根据本专利技术的实施例的T淋巴细胞可以分泌抗PD-L1抗体，具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，在体外的增殖能力、在肿瘤病人体内的增殖和生存能力显著提高，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤具有显著的定向杀伤作用，安全性高。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种慢病毒。根据本专利技术的实施例，所述慢病毒携带下列核酸分子：(a)编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子，所述抗PD-L1抗体包括：PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgGFc区具有T250Q和M248L突变；(b)编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体的胞外区识别肿瘤抗原间皮素；以及(c)编码无功能EGFR的核酸分子。将根据本专利技术实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其可以表达和分泌抗PD-L1抗体，具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，在体外的增殖能力、在肿瘤病人体内的增殖和生存能力显著增强，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤具有显著的定向杀伤作用，安全性高。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种慢病毒。根据本专利技术的实施例，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：9所示核苷酸序列的核酸分子。在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种慢病毒。根据本专利技术的实施例，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：10所示核苷酸序列的核酸分子。在本专利技术的第五方面，本专利技术提出了一种慢病毒。根据本专利技术的实施例，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：11所示核苷酸序列的核酸分子。在本专利技术的第六方面，本专利技术提出了一种慢病毒。根据本专利技术的实施例，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：12所示核苷酸序列的核酸分子。在本专利技术的第七方面，本专利技术提出了一种慢病毒。根据本专利技术的实施例，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：13所示核苷酸序列的核酸分子。在本专利技术的第八方面，本专利技术提出了一种慢病毒。根据本专利技术的实施例，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：14所示核苷酸序列的核酸分子。将根据本专利技术实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其可以表达和分泌抗PD-L1抗体，具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，在体外的增殖能力、在肿瘤病人体内的增殖和生存能力显著增强，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达MSLN及PD-L1分子的肿瘤具有显著的定向杀伤作用，且安全性更高。在本专利技术的第九方面，本专利技术提出了一种转基因淋巴细胞。根据本专利技术的实施例，所述转基因淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素，其中，所述嵌合抗原受体包括：胞外区；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述转基因淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，/n其中，/n所述嵌合抗原受体包括：/n胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别肿瘤抗原间皮素；/n跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，所述跨膜区包括CD8的跨膜段，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；/n胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括4-1BB的胞内段以及CD3ζ链；/n所述抗PD-L1融合抗体包括：/nPD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L氨基酸突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，
其中，
所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别肿瘤抗原间皮素；
跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，所述跨膜区包括CD8的跨膜段，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；
胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括4-1BB的胞内段以及CD3ζ链；
所述抗PD-L1融合抗体包括：
PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L氨基酸突变。


2.根据权利要求1所述的T淋巴细胞，其特征在于，所述抗PD-L1单链抗体具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述的T淋巴细胞，其特征在于，所述IgG1Fc区具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。


4.根据权利要求1所述的T淋巴细胞，其特征在于，所述抗PD-L1融合抗体具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。


5.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带下列核酸分子：
(a)编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子，所述抗PD-L1融合抗体包括：
PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L氨基酸突变；
(b)编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体的胞外区识别肿瘤抗原间皮素；以及
(c)编码无功能EGFR的核酸分子。


6.根据权利要求5所述的慢病毒，其特征在于，所述抗PD-L1融合抗体具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；
任选地，所述嵌合抗原受体具有SEQIDNO:4或5所示的氨基酸序列；
任选地，所述无功能EGFR具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。


7.根据权利要求6所述的慢病毒，其特征在于，所述编码抗PD-L1融合抗体的核酸分子具有SEQIDNO:7～9任一所示的核苷酸序列；
任选地，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQIDNO:10或11所示的核苷酸序列；
任选地，所述编码无功能EGFR的核酸分子具有SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。


8.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：13所示核苷酸序列的核酸分子。


9.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：14所示核苷酸序列的核酸分子。


10.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：15所示核苷酸序列的核酸分子。


11.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：16所示核苷酸序列的核酸分子。


12.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：17所示核苷酸序列的核酸分子。


13.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQIDNO：18所示核苷酸序列的核酸分子。


14.一种转基因淋巴细胞，其特征在于，所述转基因淋巴细胞共表达抗PD-L1融合抗体、无功能EGFR以及嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原间皮素，
其中，
所述嵌合抗原受体包括：
胞外区；
跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述转基因淋巴细胞的细胞膜中；
胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段；
所述抗PD-L1融合抗体包括：
PD-L1单链抗体、IgG1铰链区以及IgG1Fc区，所述PD-L1单链抗体通过IgG1铰链区与所述IgG1Fc区相连，所述IgG1Fc区具有T250Q和M248L氨基酸突变。


15.根据权利要求14所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、O...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄雪芬，陈思毅，
申请(专利权)人：艾生命序公司，
类型：发明
国别省市：美国;US