一种YAP1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，旨在提供一种YAP1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法。该间充质干细胞是以过表达YAP1基因修饰的原代间充质干细胞，其中YAP1基因来源于YAP1慢病毒载体或YAP1质粒载体，原代间充质干细胞的来源是下述任意一种人体组织：胎盘、脐带或脂肪组织。本发明专利技术获得的YAP1基因修饰的间充质干细胞，不影响MSC本身表型和分化能力；通过利用过表达YAP1基因修饰间充质干细胞，本发明专利技术可以显著促进间充质干细胞的增殖，进一步提高细胞的产量；因此能够快速获得大量的间充质干细胞用于临床干细胞移植治疗。

A Yap1 gene modified mesenchymal stem cell and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种YAP1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法专利
本专利技术属于生物
，具体涉及一种YAP1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法。
技术介绍
在再生医学和临床治疗中，由于间充质干细胞(MSCs)具有自我更新和多系分化的能力，它们已成为胚胎干细胞最有希望的替代物。近年来，陆续有临床前和临床研究证明了间充质干细胞对于免疫性疾病、心肌损伤、肝脏疾病、肺损伤、肾脏疾病和糖尿病等有明显的治疗作用。MSCs可从多种组织中分离获得，如：骨髓、胎盘、脂肪组织、滑膜组织、肺组织、脐带血、外周血等。但是，先前的研究表明，无论间充质干细胞的来源如何，单次植入细胞治疗肝病的最佳数量约为1-5×107。考虑到临床间充质干细胞移植治疗需要大量的细胞数目以及从组织获得的间充质干细胞的初始数量很少，原代间充质干细胞需要在体外进行广泛扩增才能满足临床治疗的输注数量级。因此如何快速的获得可用于临床细胞移植的细胞数一直是再生医学的研究热点。间充质干细胞的增殖能力受许多因素影响，包括来源的个体及组织、培养的条件和持续的传代的影响。未加基因修饰的间充质干细胞在体外增殖的速率较慢，扩增到临床应用数量级所需时间较长。因此，寻找和克隆表达调控间充质干细胞增殖能力的相关基因，不仅有助于推动间充质干细胞的产业化，还有助于其在临床治疗上的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种YAP1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法，以满足临床细胞移植对于大量细胞数的要求。为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：提供一种YAP1基因修饰的间充质干细胞，是以过表达YAP1基因修饰的原代间充质干细胞。本专利技术中，所述YAP1基因来源于YAP1慢病毒载体或YAP1质粒载体。本专利技术中，所述原代间充质干细胞的来源是下述任意一种人体组织：胎盘、脐带或脂肪组织。本专利技术进一步提供了前述YAP1基因修饰的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)取含有原代间充质干细胞的胎盘、脐带或脂肪组织，剪取小块；在培养皿上用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，PBS)清洗至清洗液透明后，充分剪碎；(2)将剪碎的组织块转移至50毫升离心管内，加入25毫升质量/体积浓度为0.1％的胶原酶Ⅳ，放在37℃恒温的摇床上摇晃消化30分钟；(3)向消化好的组织中加入20毫升磷酸盐缓冲液，混匀后经100微米筛网过滤；将滤液在1200转/分钟离心5分钟，去上清液保留细胞沉淀；(4)向细胞沉淀中加入5毫升含有20％胎牛血清的DMEM培养基，混匀后接种至T25培养瓶；然后置于5％CO2、37℃恒温的培养箱中；每隔3天换一次新鲜的含有20％胎牛血清的DMEM培养基；(5)待细胞50％汇合后，以感染复数为50∶1加入YAP1慢病毒载体或YAP1质粒载体，转染间充质干细胞；完成转染后得到过表达YAP1基因修饰的原代间充质干细胞YAP1-LV-MSC。所述的基因修饰的间充质干细胞在细胞扩增上的应用，特征在于通过基因修饰增加YAP1基因编码的蛋白的表达量，提高间充质干细胞增殖率。专利技术原理描述：YAP1基因编码的蛋白被称为YAP1或YAP65，是一种通过激活参与细胞增殖的基因转录并抑制凋亡基因而充当转录调节因子的蛋白，有报道被应用于癌症细胞研究。但是，将YAP1基因用于修饰间充质干细胞尚未有报道。本专利技术中的YAP1基因来源于YAP1慢病毒载体或YAP1质粒载体(即含有YAP1基因编码序列的慢病毒载体或者质粒载体)。由于YAP1基因能够使得间充质干细胞增殖速率明显加快，从而能够在短时间内获得足够的细胞数量用于临床细胞移植。因此，可以用于快速提高间充质干细胞产量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术获得的YAP1基因修饰的间充质干细胞，不影响MSC本身表型和分化能力；2、通过利用过表达YAP1基因修饰间充质干细胞，本专利技术可以显著促进间充质干细胞的增殖，进一步提高细胞的产量；因此能够快速获得大量的间充质干细胞用于临床干细胞移植治疗。附图说明图1为YAP1蛋白在过表达后的相对表达量；图2为YAP1过表达后间充质干细胞的生长曲线；图3为YAP1过表达后间充质干细胞的群体倍增时间。具体实施方式对本专利技术所用间充质干细胞的来源进行说明：本专利技术所用的各类人体组织为临床废弃物或离体人体组织。例如，实施例中的胎盘是从浙江大学医学院附属第一医院的妇产科病房获得，人体组织和细胞处理的所有方案均经医院研究伦理委员会批准(伦理号：2013–272)。本专利技术的技术方案不涉及获取人体组织过程的具体操作。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实验仪器与试剂离心管(corning，America)，离心机(eppendorf，German)，10厘米培养皿(Greiner，German)，100微米滤网(corning，America)，恒温摇床(Thermo，America)，倒置显微镜(Nikon，Japan)，RTCAS16Analyzer(ACEA，America)，培养瓶(corning，America)，CO2培养箱(Thermo，America)，垂直电泳仪(Bio-Rad，America)，电转膜仪(Bio-Rad，America)，化学发光成像系统(勤翔，中国)胶原酶Ⅳ(invitrogen，America)，DMEM(Gibco，America)，PBS(吉诺，中国)，慢病毒试剂(吉玛，中国)，polybrene(吉玛，中国)，BCA试剂盒(Thermo，America)，RIPA裂解液(碧云天，中国)，PVDF膜(Millipore，America)，YAP1抗体(Abcam，UK)，GAPDH抗体(Abcam，UK)下面结合具体实施例子，对本专利技术的技术方案详细描述。1、胎盘来源的间充质干细胞分离和培养分离培养步骤如下：(1)剪取小块胎盘组织，于10厘米培养皿上用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，PBS)清洗至胎盘组织呈淡粉色(此时清洗液应透明)；(2)将洗好的组织放置于另一个10厘米培养皿上，用干净的手术剪充分剪碎；(3)将剪碎的组织块转移至50毫升离心管内，加入25毫升浓度为0.1％(质量/体积)的胶原酶Ⅳ，放在37℃恒温摇床上摇晃消化30分钟；(4)向消化好的组织中加入20毫升磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，PBS)，混匀后经100微米筛网过滤；(5)将收获的滤液在1200转/分钟离心5分钟，去掉上清液，保留细胞沉淀；(6)向细胞沉淀中加入5毫升含有20％胎牛血清的DMEM培养基混匀接种至T25培养瓶，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中，之后每隔3天换一次新鲜的含有20％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种YAP1基因修饰的间充质干细胞，其特征在于，是以过表达YAP1基因修饰的原代间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种YAP1基因修饰的间充质干细胞，其特征在于，是以过表达YAP1基因修饰的原代间充质干细胞。


2.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于，所述YAP1基因来源于YAP1慢病毒载体或YAP1质粒载体。


3.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于，所述原代间充质干细胞的来源是下述任意一种人体组织：胎盘、脐带或脂肪组织。


4.权利要求1所述YAP1基因修饰的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取含有原代间充质干细胞的胎盘、脐带或脂肪组织，剪取小块；在培养皿上用磷酸盐缓冲液清洗至清洗液透明后，充分剪碎；
(2)将剪碎的组织块...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹红翠，冯旭东，俞炯，潘巧玲，杨金凤，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33