抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株和高通量药物筛选模型的建立及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种构建抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株的方法，同时公开了抗肥胖药物高通量筛选模型的建立及应用。主要涉及利用CRISPR/Cas9系统，设计两条独特的sgRNA，在细胞的UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase‑T2A‑tdTomato‑WPRE‑pA，特别是将luciferase和tdTomato敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1的基因位点，形成首株在UCP1启动子区域插入luciferase和tdTomato的稳转棕色脂肪细胞株，并将其应用于抗肥胖药物的高通量筛选、抗肥胖药物的评价、机体抗肥胖活性物质的评价以及UCP1检测试剂盒的开发。UCP1是特异性表达于棕色脂肪组织的解偶联蛋白，抵抗肥胖的新靶点，该稳转基因工程细胞株的构建对于应用报告基因和高内涵方法，灵敏、准确、高效地对化合物库进行高通量筛选，获得促进产热、降低体重的抗肥胖药物意义重大。

Establishment and application of genetic engineering cell line and high throughput drug screening model of anti obesity drug target UCP1

【技术实现步骤摘要】
抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株和高通量药物筛选模型的建立及应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种应用CRISPR/Cas9系统在细胞解偶联蛋白(uncouplingprotein1,UCP1)基因位点敲入luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA，替换exon1和部分intron1，构建稳转细胞株，特别是将luciferase和tdTomato敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1的基因位点的基因定向编辑方法与应用，并利用阳性克隆建立抗肥胖药物高通量筛选模型、评价抗肥胖药物、评价机体抗肥胖活性物质以及UCP1检测试剂盒的开发。
技术介绍
在过去的二十年里，定点设计核酸酶的创新使得基因组编辑技术取得了巨大地进步，如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)。然而，设计、合成以及对特定基因位点的蛋白质验证的困难限制了这些方法的可行性。基因组编辑技术关键的突破是发现了一种叫做成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)的细菌免疫系统相关RNA分子，它能够指导CRISPR相关的9(Cas9)核酸酶靶向与向导RNA(gRNA)互补的DNA序列。这种gRNA易于编程，并且设计的gRNA与Cas9表达组件的简单转导就可以高度特异性和高效性在DNA中引入双链断裂(DSB)。CRISPR还具有比ZFN和TALEN更小的优势，因此，更容易将其封装到慢病毒结构中，具有较低的脱靶剪切风险，更容易创建，成本更低，并且表现出更高的效率。CRISPR/Cas9系统在许多哺乳动物培养细胞中取得了成功的结果。随着全球肥胖人群的日益增加，肥胖已成为21世纪最大的公共健康挑战之一，据世界卫生组织(WHO)统计，全球肥胖发病率自1980年至今已增加2倍以上。肥胖是影响很多疾病的重大风险因素，如心血管疾病、糖尿病、高血脂和肿瘤等。鉴于此，美国医学会于2013年认定肥胖是一种疾病。增加锻炼，控制饮食等非药物治疗肥胖的方法往往依从性较差，而减肥药治疗则通过抑制食欲或肠道脂类吸收达到限制能量摄入进而减肥的目的，长期应用会出现抑郁、脂肪泻等副作用，一旦停药则出现明显的体重反弹。因此，寻找安全有效的减肥药是目前治疗肥胖症，进而减少代谢性疾病及其并发症的重中之重。棕色脂肪活化或促白色脂肪“棕色化”是近年来提出的新概念，通过激活棕色脂肪或促进白色脂肪出现棕色脂肪的特征表现，从而显著促进机体的能量消耗，改善糖脂代谢，增加胰岛素敏感性，因此可能成为针对肥胖症及其相关代谢异常疾病治疗的新靶点。UCP1是一种特异性表达于棕色脂肪组织的线粒体蛋白，它解偶联细胞呼吸和线粒体ATP合成，以热量的形式耗散能量。由于UCP1被认为是唯一负责棕色脂肪组织产热作用的“热基因”，因此当前研究认为UCP1的主要作用是调节棕色和米色脂肪的功能，UCP1激活具有抗肥胖作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效定点将外源基因luciferase和tdTomato敲入细胞UCP1基因位点的方法，特别是敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1基因位点的方法。本专利技术的另一目的在于应用上述稳转棕色脂肪细胞，提供一种抗肥胖药物高通量筛选模型的构建方法。本专利技术的第三个目的在于提供一种抗肥胖药物评价方法。本专利技术的第四个目的在于提供一种机体抗肥胖活性物质的评价方法。本专利技术的第五个目的在于采用本专利技术所提及的技术筛选出的药物用于抗代谢性疾病治疗，不限于肥胖，还包括糖尿病、高脂血症、代谢综合症等疾病。本专利技术的第六个目的在于提供一种用于检测UCP1的试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种高效定点将外源基因luciferase和tdTomato敲入细胞UCP1基因位点的方法，其特征在于所述方法为：(1)确定打靶策略，在分析UCP1基因结构编码序列(Codingsequences,CDS)后，设计在N端ATG之后敲入luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA-loxP-Neo-loxP,替换exon1和部分intron1；(2)靶序列的测序确认，设计引物，对靶细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证小向导RNA(smallguideRNA,sgRNA)识别序列与靶细胞系DNA序列完全一致，靶细胞系靶位点测序引物序列为如SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示；(3)Cas9/sgRNA设计，在5’端和3’端靶位点区域各设计5条sgRNA，sgRNA对应的靶向序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示，UCP1-sgRNA1序列如SEQIDNO.13所示、UCP1-sgRNA2序列如SEQIDNO.14所示、UCP1-sgRNA3序列如SEQIDNO.15所示、UCP1-sgRNA4序列如SEQIDNO.16所示、UCP1-sgRNA5序列如SEQIDNO.17所示、UCP1-sgRNA6序列如SEQIDNO.18所示、UCP1-sgRNA7序列如SEQIDNO.19所示、UCP1-sgRNA8序列如SEQIDNO.20所示、UCP1-sgRNA9序列如SEQIDNO.21所示、UCP1-sgRNA10序列如SEQIDNO.22所示；(4)Cas9/sgRNA质粒的构建，按照已设计sgRNA序列合成相应引物，通过GibsonAssembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证正确；(5)Cas9/sgRNA的活性检测，综合考虑活性、特异性因素，选择使用的sgRNA为UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6，序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.18所示，pCS-sgRNA1与pCS-sgRNA6核苷酸序列如SEQIDNO.23与SEQIDNO.24所示。(6)重组外源基因载体构建，合成LR-A片段，设计引物克隆RR片段，并将其与载体LScKO-4G连接为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR，经过酶切鉴定和测序，确认重组外源基因载体构建完成，外源基因RR片段的克隆引物序列如SEQIDNO.25与SEQIDNO.26所示，重组外源基因载体核苷酸序列如SEQIDNO.27所示；(7)阳性克隆筛选，Cas9/sgRNA质粒和重组外源基因载体转染靶细胞系，经过G418药物抗性筛选、细胞富集、再进行PCR筛选，首先筛选混合克隆，再进行连接PCR(JunctionPCR)筛选得到阳性克隆，筛选混合克隆PCR引物UCP1-L-GT-F序列如SEQIDNO.28所示、WPRE-120R序列如SEQIDNO.29所示、tdTomato-2371F序列如SEQIDNO.30所示、UCP1-R-GT-R序列如SEQIDNO.31所示，JunctionPCR引物UCP1-L-GT-F序列如SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR-Cas9系统构建UCP1启动子区域敲入荧光素酶luciferase和红色荧光蛋白tdTomato稳转细胞株的方法，其特征在于，所述方法为：(1)确定打靶策略，在分析靶基因UCP1基因结构后，设计在UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA-loxP-Neo-loxP,替换exon1和部分intron1；(2)靶序列的测序确认，设计靶位点测序引物，对靶细胞系的靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证sgRNA识别序列与靶细胞系DNA序列完全一致；(3)Cas9/sgRNA设计，基于sgRNA的设计原则，在5’端和3’端靶位点区域各设计5条sgRNA；(4)Cas9/sgRNA质粒的构建，按照已设计sgRNA序列合成相应引物，通过Gibson Assembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证正确；(5)Cas9/sgRNA的活性检测，综合考虑活性、特异性因素选择UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6进行下一步实验；(6)重组外源基因载体构建，合成LR-A片段，设计引物克隆RR片段，并将LR-A片段及RR片段与载体LScKO-4G连接为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR，经过酶切鉴定和测序，确认重组外源基因载体构建完成；(7)阳性克隆筛选，UCP1-sgRNA1、UCP1-sgRNA6和重组外源基因载体转染靶细胞系，经过G418药物抗性筛选、细胞富集、PCR筛选，得到阳性克隆。/n...

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR-Cas9系统构建UCP1启动子区域敲入荧光素酶luciferase和红色荧光蛋白tdTomato稳转细胞株的方法，其特征在于，所述方法为：(1)确定打靶策略，在分析靶基因UCP1基因结构后，设计在UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA-loxP-Neo-loxP,替换exon1和部分intron1；(2)靶序列的测序确认，设计靶位点测序引物，对靶细胞系的靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证sgRNA识别序列与靶细胞系DNA序列完全一致；(3)Cas9/sgRNA设计，基于sgRNA的设计原则，在5’端和3’端靶位点区域各设计5条sgRNA；(4)Cas9/sgRNA质粒的构建，按照已设计sgRNA序列合成相应引物，通过GibsonAssembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证正确；(5)Cas9/sgRNA的活性检测，综合考虑活性、特异性因素选择UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6进行下一步实验；(6)重组外源基因载体构建，合成LR-A片段，设计引物克隆RR片段，并将LR-A片段及RR片段与载体LScKO-4G连接为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR，经过酶切鉴定和测序，确认重组外源基因载体构建完成；(7)阳性克隆筛选，UCP1-sgRNA1、UCP1-sgRNA6和重组外源基因载体转染靶细胞系，经过G418药物抗性筛选、细胞富集、PCR筛选，得到阳性克隆。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞系为永生化棕色脂肪细胞系。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因为luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA基因。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标基因为UCP1基因。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶位点测序引物序列如SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示。


6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，sgRNA对应的靶向序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。


7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，UCP1-sgRNA1序列如SEQIDNO.13所示、UCP1-sgRNA2序列如SEQIDNO.14所示、UCP1-sgRNA3序列如SEQIDNO.15所示、UCP1-sgRNA4序列如SEQIDNO.16所示、UCP1-sgRNA5序列如SEQIDNO.17所示、UCP1-sgRNA6序列如SEQIDNO.18所示、UCP1-sgRNA7序列如SEQIDNO.19所示、UCP1-sgRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜冠华，强桂芬，何萍，刘俊成，杨秀颖，张莉，侯碧玉，徐春阳，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11