一种RVG-CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种能够穿过血脑屏障特异性识别CD70的CAR‑T细胞及制备方法，将RVG‑SCFV(Anti CD70)‑CD8

Rvg-cd70 car-t cell and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种RVG-CD70CAR-T细胞及其制备方法与应用
本专利技术属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种借助RVG蛋白靶向脑部并特异性识别CD70的CAR-T细胞及制备方法，以及其在治疗高表达CD70分子相关脑部肿瘤的药物中的应用。
技术介绍
癌症病人因放、化疗导致的免疫系统功能低下，是导致病情复发的重要原因，也是困扰医学界的一大难题。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(ChimericantigenreceptorT-cellimmuno-therapy，CAR-T)以其独特的抗肿瘤优势，已成为全球生物科技竞争的热点。CAR-T细胞是将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(SCFV)与CD8TM，4-1BB，CD3-ζ链等的胞内区偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗体受体(CAR)。患者的T细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的CAR-T细胞，能够特异性的靶向肿瘤细胞。但又不会伤及正常细胞。由于是诱导、激活自体细胞，因此该疗法没有通常的免疫排斥反应，也没有传统治疗中出现的耐药性。CAR-T细胞是由单克隆抗体的单链可变区和T细胞信号转导区连接而成，抗体与相应的肿瘤抗原结合后能以主要组织相容性复合体以非限制性方式使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。CAR的结构分为：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。胞外抗原结合区：通常由针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体的轻链及重链连接而成。铰链区：对于远离细胞膜的抗原表位，无铰链区的CAR-T细胞可以识别和结合抗原；而对于膜近端的抗原表位，一个灵活的铰链区对抗原的识别是必要的。因此针对不同肿瘤相关抗原需要调整铰链区长度，以更好发挥靶向结合能力。跨膜区：来自CD3、CD8、CD8的跨膜区常用来构建CAR，并在CAR的二聚化和T细胞活化中发挥重要作用。胞内信号区：由共刺激分子如CD8、CD134和CD137组成，其中CD8可募集PI3K、Grb2等分子来调节关键转录因子的活性。CD134能促进T细胞体外增殖且增加IL-2的分泌，CD137是肿瘤坏死因子家族受体，能激活下游的JNK，p38，MAPK和INF-κB信号途径。大多数研究者把CD8或CD137的协同共刺激信号分子融合到CD3结构域的上游。根据胞内信号传导区域的组成不同可分为3代CAR-T细胞。第1代CAR-T细胞的胞内部分仅含CD3ζ结构域，虽然能诱导T细胞的激活和最初的细胞毒性反应，但是存活时间短且只有很低或者没有IL-2的产生；第2代CAR-T细胞将共刺激分子如CD8、CD137的胞内部分融合到CD3结构域的上游，效果比第1代明显增强因而应用最广泛；第3代CAR-T细胞则同时融合2种共刺激分子到CD3结构域的上游，其抗肿瘤活性与第2代CAR-T细胞相比尚无定论。CAR-T细胞在血液肿瘤的免疫治疗中起到了重要作用，以CD19-CAR-T细胞治疗淋巴细胞肿瘤最为突出，有些已经进入II期临床试验。CAR-T细胞在实体肿瘤中的研究大部分仍处于动物实验阶段，但有些小样本的临床试验和病例报道取得了不错的疗效。脑肿瘤包括原发性脑肿瘤和脑转移瘤，其最佳治疗手段是手术彻底切除，然因正常脑组织的不可切除性及恶性肿瘤向颅内广泛浸润性生长的特点，手术大范围彻底切除极为困难。因此，如何减少脑组织的损伤、保护脑的中枢功能、最大限度地消除肿瘤仍是现如今肿瘤学者研究的方向和奋斗的目标。脑肿瘤有原发与继发两大类，原发肿瘤又分髓内与髓外，髓内肿瘤主要有胶质细胞瘤、神经细胞瘤和类胚叶间质肿瘤，髓外肿瘤主要有间质类肿瘤、上皮类肿瘤、畸胎瘤和松果体瘤等。脑胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤，在颅内各种类型肿瘤中占第一位，其发病率约占颅内肿瘤的40％～45％，常见有星形细胞瘤、星形母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突胶质母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、松果体瘤等。脑膜瘤为仅次于脑胶质瘤的第二种常见颅内肿瘤，约占颅内肿瘤总数的20％。脑膜瘤具有部位表浅、生长缓慢、与脑组织分界清楚等特点。大多数脑膜瘤属良性。瘤的组织形态可分为内皮细胞型与纤维型两大类。脑膜瘤来源于蛛网膜内皮细胞，以大脑凸面、矢状裂旁和大脑镰旁最多，其次为蝶骨嵴、鞍结节、嗅沟、小脑幕及颅后窝等几个部位，脑室内少见。可发生于任何年龄，但老人、儿童少见。CD70是肿瘤坏死因子受体(tumornecrosisfactorreceptor，TNFR)超家族的成员之一，具有调控T细胞和B细胞活化、增殖及分化的能力，在维持机体免疫应答过程中起着重要的作用。同时，在生理条件下，CD70仅短暂性地表达于活化的淋巴细胞，有研究证实，约35％的新诊断的胶质母细胞瘤患者和更高百分比的复发性肿瘤患者携带CD70。
技术实现思路
专利技术目的：针对上述现有技术，本专利技术提供了一种RVG-CD70CAR-T细胞及其制备方法和应用。技术方案：本专利技术公开了一种RVG-CD70CAR-T细胞，所述CAR-T细胞在T淋巴细胞内表达RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。即本申请CAR-T细胞以CD70结构域为靶点，在T淋巴细胞内表达RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。其中，所述T淋巴细胞来源于人外周血分离的PBMC中。所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。优选的，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8Leader的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，CD70SCFV(含(G4S)3)的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8_Hinge的分子序列如SEQIDNO.3所示，CD8TM的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。优选的，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，4-1BB的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。优选的，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，RVG的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。SEQIDNO.1(CD8Leadersequence)：MALPVTALLLPLALLLHAARPSEQIDNO.2(CD70Scfv)：QVQLVQSGGGISWFPGGSIKISGSGFTFSWFYNVWKQGPGKGIQWVSDINNQGGTLFVADSWKGKFTISKENSRNSIFIVNRSIKGYDTGWFYCAKDAGYSNHWPIFDSWGQGTIWTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQGVWSNQPSITWSPGGTWTILHCGIKSGSSDNFPTWFNQTPGQGPKILIFNTNTKHSGWPDVKFSGSIIGNKGAITIVGAQGEDD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RVG-CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞以CD70结构域为靶点，在T淋巴细胞内表达RVG-SCFV-CD8

【技术特征摘要】
1.一种RVG-CD70CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞以CD70结构域为靶点，在T淋巴细胞内表达RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的RVG-CD70CAR-T细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞来源于人外周血分离的PBMC中。


3.根据权利要求1所述的RVG-CD70CAR-T细胞，其特征在于，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。


4.根据权利要求1所述的RVG-CD70CAR-T细胞，其特征在于，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8Leader的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，CD70SCFV(含(G4S)3)的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


5.根据权利要求1所述的RVG-CD70CAR-T细胞，其特征在于，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8_Hinge的分子序列如SEQIDNO.3所示，CD8TM的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


6.根据权利要求1所述的RVG-CD70CAR-T细胞，其特征在于，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，4-1B...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪锋，郭志刚，孙裕铃，张凡，景丽，李恩洁，马颖，胡志刚，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32