一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其在Cd毒性效应研究中的应用，它包括无菌水制作、背角无齿蚌暂养、消毒、解剖取鳃、鳃片消化分解、离心收集细胞、人工合成细胞培养基制作、细胞培养步骤、Cd暴露和毒性效应分析。本发明专利技术淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法精准，细胞成活率高且存活时间长，突破了目前原代培养淡水贝类鳃细胞的存活率低、存活时间短的“瓶颈”难题，达到实验研究标准，并成功评价了Cd的细胞毒性效应。

A primary culture method of gill cells of Anodonta dorsalis and its application

【技术实现步骤摘要】
一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其应用
本专利技术涉及一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其在Cd毒性效应研究中的应用，本专利技术属于淡水贝类细胞毒理学研究

技术介绍
我国渔业生态环境重金属污染形势仍较为严峻。《2015年中国渔业生态环境状况公报》即指出我国江河天然重要渔业水域中镉(Cd)超标率为1.5％，国家级内陆水产种质资源保护区Cd超标率达到2.7％。水环境中的Cd易于沿食物链发生生物放大作用，从而导致渔业生物中Cd残留量超标。例如，我国长三角地区池塘养殖水产品中Cd的超标率甚至高达100％(和庆,彭自然,张晨,等.长三角地区池塘养殖水产品重金属含量及其健康风险评价.农业环境科学学报,2017,36(6):1070-1077)。因此，亟需对水环境中的重金属(如Cd)进行污染预警和毒性评价。淡水贝类背角无齿蚌(Anodontawoodiana)对重金属具有高积累性、低代谢性、体内积累重金属与水环境中重金属含量呈简单相关等特点，被确定为“淡水贝类观察”研究体系的专用指示生物。利用背角无齿蚌已成功监测渔业生态环境重金属的污染状况，并有效评价了Cd等重金属的毒性效应。值得注意的是，生命系统在不同水平对环境污染物胁迫之应答顺序大不相同，个体的应答效应可能要数小时到数年才能把握，而细胞的应答时间可以是数秒到数小时。鳃作为背角无齿蚌对重金属积累的关键“靶器官”，其细胞有潜力作为水环境重金属污染早期预警及毒性灵敏评价的重要研究模型。需要引起关注的是，由于淡水贝类鳃等组织的生理结构、功能分化、细胞形态等方面的特殊性，至今还没有建立起细胞系，原代细胞培养仍然是主要依托的方法。在细胞毒性效应研究中，对照组细胞的存活率≥90％是开展该研究的基本前提条件。即使是暴露时间较短的急性毒性实验，一般也要求开展连续暴露96h。然而，利用已报道的淡水贝类细胞原代培养方法，维持鳃细胞存活率≥90％的优良状态往往难以超过72h(-DikmenB,ArslanP,Kuzukιranetal.Uniosp.primarycellculturepotentialinecotoxicologyresearch.ToxinReviews,2018,37(1):75-81)，这严重限制了基于鳃细胞毒性效应的水环境重金属污染早期预警及毒性灵敏评价的开发和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是克服现有技术中存在的不足，提供一种存活率高、存活时间长的背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法。本专利技术的另一目的是提供一种背角无齿蚌鳃细胞在Cd毒性效应研究中的应用。按照本专利技术提供的技术方案，所述一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法包括以下步骤：a1、将超纯水在110～130℃下灭菌20～30min，灭菌后冷却至常温，制成无菌水；b1、将洗净的背角无齿蚌置于无菌水中暂养24～96h；c1、先向4～26℃的900～1000ml的无菌水中加入青霉素50000～500000IU、链霉素0.05～0.5g、庆大霉素0.05～5g和卡那霉素0.03～3g配制成抗生素溶液；再将洗净的背角无齿蚌置于抗生素溶液中消毒1～6h；d1、解剖出背角无齿蚌的鳃，将鳃置于经0.2～0.3μm滤头过滤的4～26℃的抗生素溶液中，并在抗生素溶液将鳃进一步剪成1～5mm2的鳃片，鳃片在抗生素溶液中消毒1～3h；e1、消毒后收集鳃片，先取鳃片质量10～50倍、4～26℃且浓度为0.025wt％～0.25wt％的链霉蛋白酶溶液，再取链霉蛋白酶溶液体积30％～50％的步骤c配制的抗生素溶液，将所取的抗生素溶液与链霉蛋白酶溶液混合在一起形成消化溶液，将鳃片置于消化溶液中分解细胞0.5～8h，然后往链霉蛋白酶溶液中与其质量相等的胎牛血清终止消化；f1、先用50～100μm无菌滤网将背角无齿蚌鳃细胞液过滤至无菌离心管，然后1000～2000r/min离心5～10min，去除清液，收集细胞沉淀；g1、在300～800ml无菌水中加入L-15基础培养基150～300ml、青霉素10000～50000IU、链霉素0.01～0.05g、庆大霉素0.1～1g、卡那霉素0.01～1g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸1～5g和左旋谷酰胺10～100ml，形成细胞培养基混合液，再取细胞培养基混合液体积10％～20％的胎牛血清并加入到细胞培养基混合液中经温度控制形成15～20℃的人工合成细胞培养基；取部分人工合成细胞培养基加入到步骤f1的离心管中，调节成细胞浓度为105～106cell/ml的细胞悬液；h1、在培养孔板的每个培养孔洞中加入细胞悬液0.5～1.5ml，培养孔板置于15～20℃的二氧化碳培养箱中进行细胞原代培养，6h即可以完成贴壁；每天用浓度为0.4wt％～1wt％的台盼蓝染色检验细胞的成活率，然后用15～20℃的人工合成细胞培养基更换掉培养孔洞中至少1/2的人工合成细胞培养基；成功获得了培养时间长达120h、成活率≥90％的背角无齿蚌原代培养鳃细胞。作为优选，步骤a1中使用的超纯水为Milli-Q级超纯水。作为优选，步骤c1中，抗生素溶液由50000～500000IU青霉素、0.05～0.5g链霉素、0.05～5g庆大霉素和0.03～3g卡那霉素配制而成。作为优选，步骤e1中，链霉蛋白酶溶液的浓度为0.025wt％～0.25wt％。一种使用背角无齿蚌原代培养鳃细胞在Cd毒性效应研究中的应用包括以下步骤：a2、应用概率单位分析计算出Cd2+对背角无齿蚌原代培养鳃细胞的LC25；b2、根据LC25采用等比法设定至少5个Cd2+浓度梯度暴露组及1个空白对照组，每个Cd2+浓度梯度暴露组均设置4～6个平行组；c2、将背角无齿蚌细胞浓度为105～106cell/ml的细胞悬液分别接种到第一培养孔板和第二培养孔板中，第一培养孔板中每孔接种100～200μL细胞悬液，第二培养孔板中每孔接种0.5～1.5mL细胞悬液，培养6～24h以保证细胞贴壁；d2、用人工合成细胞培养基分别配制出目标Cd2+浓度2～10倍的Cd2+母液，在相同温度条件下，贴壁吸出孔板中1/10～1/2的人工合成细胞培养基，然后再贴壁缓缓加入等量的Cd2+母液，即得到设定的5个Cd2+浓度梯度暴露组；空白对照组更换等量的无Cd2+人工合成细胞培养基，暴露时间为6～96h；e2、第一培养孔板用于检测细胞活力，第二培养孔板上清用于检测抗氧化因子SOD、抗氧化因子CAT及磷酸酶AcP毒理学指标。本专利技术淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法精准，细胞成活率高且存活时间长，突破了目前原代培养淡水贝类鳃细胞的存活率低、存活时间短的“瓶颈”难题，达到实验研究标准。基于原代培养的鳃细胞，可用于重金属等多种污染物的细胞毒理学研究，在水环境重金属污染早期预警及毒性灵敏评价等领域具有广阔的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法，其特征是该培养方法包括以下步骤：/na1、将超纯水在110~130℃下灭菌20~30min，灭菌后冷却至常温，制成无菌水；/nb1、将洗净的背角无齿蚌置于无菌水中暂养24~96h；/nc1、先向4~26℃的900~1000 ml的无菌水中加入青霉素50000~500000 IU、链霉素0.05~0.5g、庆大霉素0.05~5 g和卡那霉素0.03~3g配制成抗生素溶液；再将洗净的背角无齿蚌置于抗生素溶液中消毒1~6 h；/nd1、解剖出背角无齿蚌的鳃，将鳃置于经0.2~0.3 μm滤头过滤的4~26℃的抗生素溶液中，并在抗生素溶液将鳃进一步剪成1~5 mm

【技术特征摘要】
1.一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法，其特征是该培养方法包括以下步骤：
a1、将超纯水在110~130℃下灭菌20~30min，灭菌后冷却至常温，制成无菌水；
b1、将洗净的背角无齿蚌置于无菌水中暂养24~96h；
c1、先向4~26℃的900~1000ml的无菌水中加入青霉素50000~500000IU、链霉素0.05~0.5g、庆大霉素0.05~5g和卡那霉素0.03~3g配制成抗生素溶液；再将洗净的背角无齿蚌置于抗生素溶液中消毒1~6h；
d1、解剖出背角无齿蚌的鳃，将鳃置于经0.2~0.3μm滤头过滤的4~26℃的抗生素溶液中，并在抗生素溶液将鳃进一步剪成1~5mm2的鳃片，鳃片在抗生素溶液中消毒1~3h；
e1、消毒后收集鳃片，先取鳃片质量10~50倍、4~26℃且浓度为0.025wt%~0.25wt%的链霉蛋白酶溶液，再取链霉蛋白酶溶液体积30%~50%的步骤c配制的抗生素溶液，将所取的抗生素溶液与链霉蛋白酶溶液混合在一起形成消化溶液，将鳃片置于消化溶液中分解细胞0.5~8h，然后往链霉蛋白酶溶液中与其质量相等的胎牛血清终止消化；
f1、先用50~100μm无菌滤网将背角无齿蚌鳃细胞液过滤至无菌离心管，然后1000~2000r/min离心5~10min，去除清液，收集细胞沉淀；
g1、在300~800ml无菌水中加入L-15基础培养基150~300ml、青霉素10000~50000IU、链霉素0.01~0.05g、庆大霉素0.1~1g、卡那霉素0.01~1g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸1~5g和左旋谷酰胺10~100ml，形成细胞培养基混合液，再取细胞培养基混合液体积10%~20%的胎牛血清并加入到细胞培养基混合液中经温度控制形成15~20℃的人工合成细胞培养基；取部分人工合成细胞培养基加入到步骤f1的离心管中，调节成细胞浓度为105~106cell/ml的细胞悬液；
h1、在培养孔板的每个培养孔洞中加入细胞悬液0.5~1.5ml，培养孔板置于15~20℃的二氧化碳培养箱中进行细胞原代培养，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈修报，杨健，刘洪波，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32