动物细胞灌流培养的方法技术

本发明专利技术涉及生物工程的细胞培养技术领域，尤其是涉及一种动物细胞灌流培养的方法。该灌流培养的方法包括：动物细胞接种于生物反应器中进行批培养至第2～3天，进行灌流培至第30～35天；起始谷氨酰胺、葡萄糖的浓度分别为2～4mM、6～10g/L；体系中谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或葡萄糖的浓度低于1～4.5g/L时，调整所述灌流速率至1.2～2RV/day；当调整所述灌流速率至1.2～2RV/day后，体系中谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或葡萄糖的浓度低于1～4.5g/L时，提高灌流培养的培养基中谷氨酰胺及葡萄糖的浓度。本发明专利技术的培养方法极大的提高了细胞密度、细胞活率和单位体积产率。

【技术实现步骤摘要】
动物细胞灌流培养的方法
本专利技术涉及生物工程的细胞培养
，尤其是涉及一种动物细胞灌流培养的方法。
技术介绍
动物细胞培养是一种始于20世纪初，目前被生物和医学等领域广泛采用的方法。常用的动物细胞培养分为批次培养、补料批次培养、灌流培养等。其中灌流培养能使培养过程中的培养基不断被更新，及时满足细胞对营养的需求，同时能移除乳酸、铵离子等有害代谢产物。因此，该种方法有效地提高了动物细胞密度和活率，延长了细胞的培养时间，使蛋白的产量得到大幅提升。目前，对于灌流培养的研究主要在于两个方面：一方面是细胞截留装置的优化，目的是增加截留率同时减少对细胞的损伤；另一方面是灌流策略的优化，目的是用较少的培养基表达增加目标蛋白表达量。因而，开发一种能够实现细胞高密度、高活率、高产量，同时维持培养体系稳态，蛋白质量均一的灌流培养工艺具有重要意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种动物细胞灌流培养的方法，该方法能够促进细胞密度的增加，保持细胞的高活率。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：动物细胞灌流培养的方法，包括如下步骤：动物细胞接种于生物反应器中进行批培养至第2～3天，进行灌流培至第30～35天；所述灌流培养的灌流速率为0.5～2.0RV/day；所述灌流培养的培养基中，起始谷氨酰胺的浓度为2～4mM，起始总葡萄糖的浓度为6～10g/L；所述灌流培养过程中，当所述灌流培养的体系中，谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或总葡萄糖的浓度低于1.0～4.5g/L时，调整所述灌流速率至1.2～2.0RV/day；当调整所述灌流速率至1.2～2.0RV/day后，所述灌流培养的体系中，谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或总葡萄糖的浓度低于1.0～4.5g/L时，调整所述灌流培养的培养基中，谷氨酰胺的浓度为6～8mM，总葡萄糖的浓度为16～25g/L。本专利技术的动物细胞的灌流培养的方法，提高了总葡萄糖和谷氨酰胺的浓度，同时配合调整提高了灌流速率，细胞密度得到了极大的提高，同时细胞活率和单位体积产率得到了极大的提升。本专利技术的灌流培养工艺，采用控制总葡萄糖和谷氨酰胺下限，根据细胞代谢提高灌流培养基营养，结合调控培养基灌流速率，能够降低副产物积累等，为实现高密度、高产率的细胞培养灌流优化工艺提供了广阔的应用前景。其中，批培养是指将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。在细胞批培养的过程中，不向培养体系中补加营养物质，而只向培养基中通入氧，能够控制的参数只有pH值、温度和通气量。因此细胞所处的生长环境随着营养物质的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化。在本专利技术一具体实施方式中，所述批培养的基础培养基为ActiPro培养基。在本专利技术一具体实施方式中，所述灌流培养的基础培养基为ActiPro培养基；所述灌流培养的补料培养基包括CellBoost7a和CellBoost7b。在本专利技术一具体实施方式中，补料培养基中，CellBoost7a和CellBoost7b的体积比为10﹕(1～5)，优选为10﹕(1～3)。在本专利技术的具体实施方式中，补料培养基可以为在基础培养基ActiPro培养基中加入3％～5％体积分数的CellBoost7a和0.5％～1.5％体积分数的CellBoost7b。在本专利技术一具体实施方式中，当调整所述灌流速率至1.2～2.0RV/day后，所述灌流培养的体系中，谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或总葡萄糖的浓度低于1.0～4.5g/L时，补料培养基为含5％体积分数的CellBoost7a和1.5％体积分数的CellBoost7b的ActiPro培养基。在本专利技术的具体实施方式中，所述动物细胞由以下各者所构成的群组中选出：CHO(包括，但不限于CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO-S)、HEK293、BHK细胞系。在本专利技术的具体实施方式中，稳定表达的单克隆抗体的CHO最高细胞密度为(80～160)×106/mL。在本专利技术的具体实施方式中，采用一定的放流速率来调控目标细胞密度。所述放流速率为0～0.2RV/day。通常，目标细胞密度可以为(80～150)×106/mL。在本专利技术一具体实施方式中，放流速率为0.10～0.20RV/day；优选的，所述放流速率为0.15RV/day。具体的，所述灌流培养第6～8天开始时，开启放流，所述放流速率为0.15RV/day。通过采用上述放流速率直至灌流培养完成，能够保证体系中的细胞密度在一定范围内。同时采用上述灌流、放流速率，使得培养过程中，氨离子浓度低于8～10mM，乳酸浓度低于2～4g/L。在本专利技术一具体实施方式中，所述灌流培养的第6～8天开始时，调节灌流培养的培养基中总葡萄糖含量为16～20g/L；其余条件不变。在本专利技术一具体实施方式中，所述灌流培养的第15～17天开始时，调节灌流培养的培养基中总葡萄糖含量为10～16g/L；其余条件不变。在本专利技术一具体实施方式中，所述灌流培养从开始至第15～20天时，补料培养基为含5％体积分数的CellBoost7a和0.5％体积分数的CellBoost7b的ActiPro培养基；所述灌流速率为0.5～1.2RV/day，优选为0.8～1.0RV/day，更优选为1.0RV/day。在本专利技术一具体实施方式中，所述灌流培养的第15～20天开始时，调整所述灌流速率为1.2～2.0RV/day，优选为1.5～2.0RV/day，更优选为1.5RV/day。采用该灌流速率直至灌流培养完成。如可以在灌流培养的第20天开始时，调整所述灌流速率为1.2～2.0RV/day。在本专利技术一具体实施方式中，所述灌流培养第25～28天开始时，补料培养基为含5％体积分数的CellBoost7a和1.5％体积分数的CellBoost7b的ActiPro培养基。在本专利技术一具体实施方式中，所述细胞的接种密度为(0.5～1.0)×106cells/mL，优选为0.5×106cells/mL。在本专利技术一具体实施方式中，所述灌流培养采用交替式切向流培养方式。具体的可采用ATF细胞截留设备，将ATF细胞截留设备与机械搅拌式生物反应器连用，无血清悬浮培养CHO细胞。在本专利技术一具体实施方式中，培养过程中，温度维持在36～37℃，pH值为6.7～7.3，溶氧浓度即空气饱和度为40％～90％。培养过程中的搅拌速度为190～290rpm。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术的培养工艺，根据细胞代谢情况，改变灌流培养基比例，结合调控培养基灌流速率，降低副产物积累，以适合动物细胞连续灌流培养，具有可控性强、过程控制简单，方便操作等特点，为实现高密度、高产率的细胞培养灌流优化工艺提供了广阔的应用前景；(2)采用本专利技术的灌流培养的方法，细胞密度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.动物细胞灌流培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n动物细胞接种于生物反应器中进行批培养至第2～3天，进行灌流培至第30～35天；所述灌流培养的灌流速率为0.5～2.0RV/day；/n所述灌流培养的培养基中，起始谷氨酰胺的浓度为2～4mM，起始总葡萄糖的浓度为6～10g/L；/n所述灌流培养过程中，当所述灌流培养的体系中，谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或总葡萄糖的浓度低于1.0～4.5g/L时，调整所述灌流速率至1.2～2.0RV/day；当调整所述灌流速率至1.2～2.0RV/day后，所述灌流培养的体系中，谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或总葡萄糖的浓度低于1.0～4.5g/L时，调整所述灌流培养的培养基中，谷氨酰胺的浓度为6～8mM，总葡萄糖的浓度为16～25g/L。/n

【技术特征摘要】
1.动物细胞灌流培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：
动物细胞接种于生物反应器中进行批培养至第2～3天，进行灌流培至第30～35天；所述灌流培养的灌流速率为0.5～2.0RV/day；
所述灌流培养的培养基中，起始谷氨酰胺的浓度为2～4mM，起始总葡萄糖的浓度为6～10g/L；
所述灌流培养过程中，当所述灌流培养的体系中，谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或总葡萄糖的浓度低于1.0～4.5g/L时，调整所述灌流速率至1.2～2.0RV/day；当调整所述灌流速率至1.2～2.0RV/day后，所述灌流培养的体系中，谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或总葡萄糖的浓度低于1.0～4.5g/L时，调整所述灌流培养的培养基中，谷氨酰胺的浓度为6～8mM，总葡萄糖的浓度为16～25g/L。


2.根据权利要求1所述的动物细胞灌流培养的方法，其特征在于，所述灌流培养的基础培养基为ActiPro培养基；所述灌流培养的补料培养基包括CellBoost7a和CellBoost7b；
可选的，所述批培养的基础培养基为ActiPro培养基。


3.根据权利要求2所述的动物细胞灌流培养的方法，其特征在于，所述补料培养基中，CellBoost7a和CellBoost7b的体积比为10﹕(1～5)；
优选的，所述补料培养基中，CellBoost7a和CellBoost7b的体积比为10﹕(1～3)。


4.根据权利要求1-3任一项所述的动物细胞灌流培养的方法，其特征在于，当调整所述灌流速率至1.2～2.0RV/day后，所述灌流培养的体系中，谷氨酰胺的浓度低于0.5～2.5mM和/或总葡萄糖的浓度低于1.0～4.5g/L时，补料培养基为含5％体积分数CellBoost7a和1.5％体积分数CellBoost7b的ActiPro培养基。


5.根据权利要求1所述的动物细胞灌流培养的方法，其特征在于，通...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗颖娣，薛圣杰，郑军洁，黄光诚，杨晓明，
申请(专利权)人：杭州奕安济世生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33