一种降低抗体半乳糖基化的方法技术

本发明专利技术提供了一种降低抗体半乳糖基化的方法，涉及生物技术领域。包括：在培养表达所述抗体的细胞的过程中使用半乳糖类似物，所述半乳糖类似物选自式(1)的化合物或其生物学可接受的盐，其中，R1、R2、R4分别独立地选自卤素或

【技术实现步骤摘要】
一种降低抗体半乳糖基化的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种降低抗体半乳糖基化的方法。

技术介绍

[0002]糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类分子转移至蛋白质的特定位置。起始于细胞内质网，结束于细胞高尔基体。常见的糖基化修饰为甘露糖基化、岩藻糖基化、半乳糖基化和唾液酸化。糖链上的结构和组成会显著影响蛋白的稳定性、安全性和有效性。
[0003]单克隆抗体作为一种典型的糖蛋白治疗药物，其Fc段的糖基化是抗体蛋白翻译后修饰的重要指标，单克隆抗体在体内的生理活性受2种独立的机制调节：靶向并中和抗原或者引发细胞凋亡以及抗体Fc效应功能，其中抗体Fc效应功能包括抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)。
[0004]研究发现，抗体的Fc段效应功能与位于该区域的寡糖链有关。而半乳糖基化为糖基化中的常见类型之一，其对抗体的活性也有影响。尽管它似乎不影响抗体与抗原的结合，但据报道，提高IgG抗体半乳糖修饰比例会显著增强CDC效应。并且，半乳糖增加可能会提高抗体唾液酸化水平，唾液酸化水平增强可以提高糖蛋白在血清中的半衰期；但是，半乳糖增加也会降低ADCC效应，因此，降低抗体半乳糖可能防止ADCC效应降低。这样就要求在细胞构建中获得符合要求的细胞株或者在细胞培养过程中开发出一种可调控抗体半乳糖基化至合适水平的工艺方法。
[0005]另外，在抗体生物类似药的开发过程中，往往需要和原研药保持较为一致的产品质量要求。糖型作为抗体的关键质量属性之一，需要控制在与原研药较为相似的水平，而半乳糖基化作为糖基化修饰的一种，其可影响糖谱中的多个糖型比例，如G0F、G1F、G2F、G1等。故，在上游工艺开发时需要开发出一种合适的细胞培养工艺方法进行抗体的糖型调控，以保证糖谱中各糖型与原研药可比。
[0006]常见抗体糖谱中的糖型为Man5、G0F、G1F、G2F、G0、G1等。在抗体的生产过程中，使用的细胞株、细胞培养工艺参数以及培养基成分等均可影响单克隆抗体的半乳糖基化。因此对细胞株改造、细胞培养工艺参数优化和培养基成分优化等可以调控半乳糖基化。
[0007]在现有技术中，主要是采用以下几种手段调控半乳糖基：(1)在细胞构建中采用基因工程技术敲除半乳糖基化修饰过程中如半乳糖转移酶等关键酶的编码基因以降低半乳糖基化比例，或者降低关键酶的活性；(2)优化细胞培养基成分，如加入Mn
2+
、Zn
2+
等离子；(3)改变细胞培养中的工艺参数，如降低细胞培养过程中的溶氧(DO)控制(Kunkel等，1998)、调整细胞培养过程中pH的控制范围(M
ü
thing等，2003)、降低培养过程中的培养温度(Sou等，2015)；在培养过程中添加谷丙二肽(Ala
‑
Gln)降低半乳糖基化比例；在培养过程中添加全乙酰基半乳糖(α
‑2‑
F全乙酰基半乳糖或β
‑2‑
F全乙酰基半乳糖)，降低半乳糖基化比例。这些方法主要的缺陷在于：在基因水平上敲除关键酶基因或下调关键酶基因表达的方法：一方面可能涉及相关基因技术专利壁垒，另一方面是要把半乳糖基化控制到目标水平
的难度系数较大，且开发周期长。优化培养基成分：不仅受商业化培养基限制，而且调控效果有限，亦有可能影响到其他质量属性。改变细胞培养中的工艺参数：降低DO控制，不利于细胞生长和产品表达及产品质量控制，并且在放大生产中较难稳定地控制；pH控制不是一个共性调控方法，因为在不同细胞和不同抗体产品中可能会有较大差异，因此调控效果不确定；降低培养温度，会明显降低细胞生长和代谢速率，会显著降低蛋白产量，且对半乳糖基化的调控效果有限；添加谷丙二肽(Ala
‑
Gln)：因为此添加物是氨基酸二肽，因此在不同培养基效果差异较大，另一方面由于此添加物会涉及到氨基酸代谢并且会导致代谢中铵的积累，从而影响细胞生长及代谢，甚至影响抗体的某些质量属性；全乙酰基半乳糖在浓度高于60μM时就对细胞生长、代谢及蛋白表达有负面影响，并且工艺稳定性未知，是否能进行商业化生产也是不确定的。因此，有必要提供一种新的抗体半乳糖基的调控方法。
[0008]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种降低抗体半乳糖基化的方法，所述方法在细胞培养过程中添加一定浓度的半乳糖类似物，能够有效、稳定地调控半乳糖基化，使各糖型比例控制在目标水平附近。
[0010]本专利技术提供的技术方案如下：
[0011]一种降低抗体半乳糖基化的方法，包括：在培养表达所述抗体的细胞的过程中使用半乳糖类似物，所述半乳糖类似物选自式(1)的化合物或其生物学可接受的盐：
[0012][0013]其中，R1、R2和R4分别独立地选自卤素或OH中的一种；R3选自
‑
OH和
‑
OAc。
[0014]本专利技术方法基于在半乳糖类似物存在的情况下，其会与UDP结合形成复合物，与UDP
‑
Gal竞争性争夺半乳糖转移酶的结合位点，从而抑制该酶的活性，阻断半乳糖基化修饰，因此，在在细胞培养过程中，添加一定浓度的半乳糖类似物以降低半乳糖基化修饰水平，从而调控N
‑
糖谱中各糖型的比例。
[0015]在一个实施方案中，所述卤素包括F、Cl、Br和I。
[0016]在一个实施方案中，所述半乳糖类似物包括2
‑
脱氧
‑2‑
氟
‑
D
‑
半乳糖(2FG)、4
‑
脱氧
‑4‑
氟
‑
D
‑
半乳糖(4FG)和/或6
‑
脱氧
‑6‑
氟
‑
D
‑
半乳糖(6FG)。
[0017]在一个优选实施方案中，所述半乳糖类似物为2
‑
脱氧
‑2‑
氟
‑
D
‑
半乳糖(2FG)。D
‑
半乳糖的结构式如下式A)所示，2
‑
脱氧
‑2‑
氟
‑
D
‑
半乳糖的结构式如式B)所示。
[0018][0019]在一个实施方案中，所述抗体为已知的单克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体包括利妥昔单抗、阿达木单抗、曲妥珠单抗、奥马珠单抗、贝伐单抗和雷珠单抗。
[0020]在一个实施方案中，所述抗体包括IgG1、IgG2、IgG4，优选IgG1。
[0021]在一个实施方案中，所述半乳糖类似物在反应器培养阶段接种表达所述抗体的细胞的当天添加，和/或在接种后的第3～4天添加。
[0022]在一个实施方案中，所述半乳糖类似物的添加终浓度为50～200μM，包括但不限于50μM、60μM、70μM、80μM、90本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降低抗体半乳糖基化的方法，其特征在于，包括：在培养表达所述抗体的细胞的过程中使用半乳糖类似物，所述半乳糖类似物选自式(1)的化合物或其生物学可接受的盐：其中，R1、R2和R4分别独立地选自卤素或
‑
OH中的一种；R3选自
‑
OH或
‑
OAc。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述卤素包括F、Cl、Br和I。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半乳糖类似物包括2
‑
脱氧
‑2‑
氟
‑
D
‑
半乳糖、4
‑
脱氧
‑4‑
氟
‑
D
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半乳糖和/或6
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脱氧
‑6‑
氟
‑
D
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【专利技术属性】
技术研发人员：代争，张国锋，郑军洁，杨晓明，叶峰，
申请(专利权)人：杭州奕安济世生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：