采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法技术

本发明专利技术涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法。采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法，包括如下步骤：采用洗脱缓冲液洗脱亲和层析捕获的目标蛋白；洗脱缓冲液选自pH3.4～3.8的NaAc

【技术实现步骤摘要】
采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法


[0001]本专利技术涉及抗体纯化
，尤其是涉及一种采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法。

技术介绍

[0002]亲和层析是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法，可以用于生物分子的分离纯化。
[0003]采用亲和层析处理洗脱下的产品的pH相对较低，更适合进行低pH灭活；相较于SD灭活避免了试剂残留等问题。但是，亲和层析后低pH处理过程中存在抗体聚集的情况，现有技术中的洗脱策略并不能解决大部分情况下亲和层析后低pH过程中抗体聚集的问题。
[0004]因而，急需针对不同情况，提供适于亲和层析洗脱过程中保护和稳定抗体的洗脱缓冲体系，减少低pH灭活过程中抗体因为不稳定而聚集、提高产品纯度的纯化策略。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法，以解决现有技术中存在的亲和层析后低pH灭活过程抗体聚集的技术问题。
[0007]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008]采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法，包括如下步骤：
[0009]采用洗脱缓冲液洗脱亲和层析捕获的目标蛋白；
[0010]所述洗脱缓冲液选自pH 3.4～3.8的NaAc
‑
HAc缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和精氨酸缓冲液中的至少一种；
[0011]所述NaAc
‑
HAc缓冲液的浓度为45～100mM，所述甘氨酸缓冲液的浓度为0.01～1.0M，所述柠檬酸缓冲液的浓度为20～100mM，所述精氨酸缓冲液的浓度为0.01～1.0M。
[0012]现有技术中，在亲和层析过程中采用的常规洗脱缓冲液体系，亲和洗脱后，一般有两种方式选择灭活：(1)低pH孵育，然后快速中和；(2)不进行低pH灭活，直接选择SD灭活。对于目前的方案，目的蛋白如果在低pH条件下灭活，会导致聚集体含量升高。工艺无法满足抗体生产需求。若采用相对较高的低pH进行灭活，保证聚体含量不上升，但这样会影响病毒灭活效果，病毒灭活效果可能无法达到法规要求。而对于另一种灭活方法SD灭活，会存在后续去除及残留问题等。病毒灭活步骤对于抗体来说是法规要求的重要且必须步骤。
[0013]在本专利技术的具体实施方式中，所述洗脱缓冲液选自缓冲液A～缓冲液F中的至少一种：
[0014]缓冲液A：pH 3.4～3.8、45～100mM NaAc
‑
HAc缓冲液；
[0015]缓冲液B：pH 3.4～3.8、含50～200mM NaCl的45～100mM NaAc
‑
HAc缓冲液；
[0016]缓冲液C：pH 3.4～3.8、0.01～1.0M甘氨酸缓冲液；
[0017]缓冲液D：pH 3.4～3.20～100mM柠檬酸缓冲液；
[0018]缓冲液E：pH 3.4～3.8、含0.01wt％～0.1wt％聚山梨酯80的45～100mM NaAc
‑
HAc缓冲液；
[0019]缓冲液F：pH 3.4～3.8、0.01～1.0M精氨酸缓冲液。
[0020]本专利技术提供多种适于亲和层析过程的洗脱缓冲液，可减少亲和层析后低pH灭活过程中抗体的聚集，极大的提高目标蛋白的纯度。
[0021]在本专利技术的具体实施方式中，所述洗脱缓冲液的用量为5～6CV。
[0022]在本专利技术的具体实施方式中，调节所述洗脱的线性流速使目标蛋白的保留时间为2～5min。
[0023]在本专利技术的具体实施方式中，所述亲和层析的填料包括Praesto Jetted A50、MabSelect Sure、MabSelect Sure LX和MabSelect Prism A中的任一种或多种。
[0024]在本专利技术的具体实施方式中，所述目标蛋白包括CHO细胞表达的单克隆抗体和融合蛋白中的任一种。
[0025]在本专利技术的具体实施方式中，所述CHO细胞表达的单克隆抗体包括IgG1、IgG2和IgG4中的至少一种；所述融合蛋白包括Fc融合蛋白。
[0026]在本专利技术的具体实施方式中，当目标蛋白为IgG1时，采用所述缓冲液C或所述缓冲液D进行所述洗脱；当目标蛋白为IgG2时，采用所述缓冲液A或所述缓冲液E进行所述洗脱；当目标蛋白为IgG4时，采用所述缓冲液A、所述缓冲液B或所述缓冲液F进行所述洗脱。
[0027]在本专利技术的具体实施方式中，在亲和层析上样后，在所述洗脱前，采用冲洗缓冲液进行冲洗。
[0028]在本专利技术的具体实施方式中，所述冲洗包括：采用第一冲洗缓冲液冲洗3～4CV后，采用第二冲洗缓冲液冲洗3～4CV，再采用第三冲洗缓冲液冲洗3～4CV；其中，所述第一冲洗缓冲液为pH 7.3～7.5、含145～155mM NaCl的45～55mM Tris
‑
HAc缓冲液；所述第二冲洗缓冲液为pH 5.4～5.6、含0.95～1.05M NaCl的45～55mM Tris
‑
HAc缓冲液，或pH 5.4～5.6、含0.95～1.05M NaCl的45～55mM柠檬酸钠缓冲液；所述第三冲洗缓冲液为pH7.3～7.5、含145～155mM NaCl的45～55mM Tris
‑
HAc缓冲液，或pH 5.4～5.6、45～55mM柠檬酸钠缓冲液。
[0029]在本专利技术的具体实施方式中，当所述洗脱缓冲液为缓冲液D时，所述第二冲洗缓冲液为pH 5.4～5.6、含0.95～1.05M NaCl的45～55mM柠檬酸钠缓冲液；所述第三冲洗缓冲液为pH 5.4～5.6、45～55mM柠檬酸钠缓冲液。
[0030]在本专利技术的具体实施方式中，还包括：对蛋白洗脱液进行灭活和中和；所述灭活为低pH孵育灭活。进一步的，所述低pH孵育灭活包括：于pH3.4～3.8的条件下孵育0.5～2h。所述中和包括：调节所述孵育后的蛋白洗脱液的pH至5.0～8.0。
[0031]在实际操作中，采用pH调节剂调节所述蛋白洗脱液的pH至3.4～3.8，采用pH调节剂调节所述孵育后的蛋白洗脱液的pH至5.0～8.0。
[0032]在本专利技术的具体实施方式中，所述pH调节剂选自醋酸、Tris和柠檬酸。进一步的，所述pH调节剂的浓度为0.95～1.05M，如可以为1M。醋酸和柠檬酸用于调低pH，Tris用于调高pH。
[0033]在本专利技术的具体实施方式中，当所述洗脱缓冲液为缓冲液D时，采用柠檬酸缓冲液调节所述蛋白洗脱液的pH至3.4～3.8；当所述洗脱缓冲液为缓冲液A、B、C、E、F中的任一种
时，采用醋酸缓冲液调节所述蛋白洗脱液的pH至3.4～3.8。
[0034]在本专利技术的具体实施方式中，所述灭活和中和后的蛋白洗脱液中，高聚体含量≤2.1wt％，优选≤2.0wt％。
[0035]在本专利技术的具体实施方式中，所述亲和层析纯化的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用洗脱缓冲液洗脱亲和层析捕获的目标蛋白；所述洗脱缓冲液选自pH 3.4～3.8的NaAc
‑
HAc缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和精氨酸缓冲液中的至少一种；所述NaAc
‑
HAc缓冲液的浓度为45～100mM，所述甘氨酸缓冲液的浓度为0.01～1.0M，所述柠檬酸缓冲液的浓度为20～100mM，所述精氨酸缓冲液的浓度为0.01～1.0M。2.根据权利要求1所述的采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液选自缓冲液A～缓冲液F中的至少一种：缓冲液A：pH 3.4～3.8、45～100mM NaAc
‑
HAc缓冲液；缓冲液B：pH 3.4～3.8、含50～200mM NaCl的45～100mM NaAc
‑
HAc缓冲液；缓冲液C：pH 3.4～3.8、0.01～1.0M甘氨酸缓冲液；缓冲液D：pH 3.4～3.8、20～100mM柠檬酸缓冲液；缓冲液E：pH 3.4～3.8、含0.01wt％～0.1wt％聚山梨酯80的45～100mM NaAc
‑
HAc缓冲液；缓冲液F：pH 3.4～3.8、0.01～1.0M精氨酸缓冲液。3.根据权利要求1所述的采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液的用量为5～6CV；优选的，调节所述洗脱的线性流速使目标蛋白的保留时间为2～5min。4.根据权利要求1所述的采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法，其特征在于，所述亲和层析的填料包括Praesto Jetted A50、MabSelect Sure、MabSelect Sure Lx和MabSelect Prism A中的任一种或多种。5.根据权利要求1所述的采用亲和层析纯化减少抗体聚集的方法，其特征在于，所述目标蛋白包括CHO细胞表达的单克隆抗体和融合蛋白中的任一种；优选的，所述CHO细胞表达的单克隆抗体包括IgG1、IgG2和IgG4中的至少一种；所述融合蛋白包括Fc融合蛋白。6.根据权利要求2所述的采用亲和层析纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓渊，张赶，梁泊宁，周佳豪，王贵卫，蔡子健，杨晓明，叶峰，
申请(专利权)人：杭州奕安济世生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：