一种调节蛋白类药物半乳糖基化水平的CHO细胞培养方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种调节蛋白类药物半乳糖基化水平的CHO细胞培养方法。该培养方法包括基础培养阶段和补料培养阶段，在补料培养阶段，除补加补料培养基外，还补加L

【技术实现步骤摘要】
一种调节蛋白类药物半乳糖基化水平的CHO细胞培养方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种调节蛋白类药物半乳糖基化水平的CHO细胞培养方法。

技术介绍

[0002]糖基化是蛋白类药物重要的翻译后修饰，糖基化最常见两种形式为O
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糖(寡糖与含羟基氨基酸如Ser、Thr或Tyr连接)与N
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糖(寡糖与Asn
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X
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Ser/Thr连接，X为除Pro外任何氨基酸)。蛋白糖基化起始于内质网及高尔基体，在糖基转移酶和糖苷酶及底物作用下切除葡萄糖(Glucose)及甘露糖(Mannose)残基并连接N
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乙酰葡糖胺(GlcNAc)、唾液酸(Sialic Acid)、岩藻糖(Fucose)、半乳糖(Galactose)等糖基团形成复杂且多样的糖型结构，对于抗体而言，这些糖型基团分布直接影响着抗体免疫原性及生物学功能。其中，半乳糖基化的建立是利用半乳糖作为半乳糖基化链式反应的组成单元，通过半乳糖基转移酶将半乳糖连接于紧邻的N
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乙酰葡糖胺糖，半乳糖基化修饰通过影响抗体Fc片段空间构象，增加其与C1q受体结合能力，从而达到增强补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity；CDC效应)。对于有补体依赖的细胞毒性(CDC)效应的抗体，增加半乳糖基化修饰可提高其CDC效应从而增强其对靶细胞杀伤作用。对于没有或不需要CDC效应(比如采用不同lgG亚型或Fc糖修饰位点改造的方式使其丧失Fc受体结合功能)的抗体，在工艺过程中控制半乳糖基化修饰同样非常重要。半乳糖基化修饰极易受上游工艺参数、培养规模、反应器材质、场地变更及原材料等多种因素影响，半乳糖基修饰的批间一致性也是衡量抗体药物生产工艺可控性及稳定性的重要指标。目前，可以通过调控上游工艺中pH、pCO2或金属离子添加剂等调节半乳糖基化修饰，但此类调控方式通常伴随其它蛋白质量及产量的降低。
[0003]WO2012149197采用向完全培养基中添加锰或半乳糖的方法以调节重组表达抗体的半乳糖基化水平。抗体半乳糖基化修饰偏低及批次间不稳定在单克隆抗体药物开发中常有发生，需提供一种增加抗体半乳糖基化修饰的方法，使半乳糖基化修饰提升，同时增强工艺的可控性，提高抗体的质量。
[0004]CHO作为宿主细胞生产单克隆抗体或者融合蛋白类药物时，糖型比例是一个重要质量属性，不同糖型比例会影响药物分子的稳定性。大约95％常规CHO细胞产生的重组IgG是以半乳糖为末端糖，因此，以CHO细胞为表达系统的单克隆抗体或者融合蛋白，半乳糖基化水平是关键的质量属性。半乳糖基化修饰是单克隆抗体重要的翻译后修饰，例如影响抗体药物可控性、稳定性、批间一致性，此外，其可增加抗体CDC效应，然而半乳糖基化在培养工艺中较难调控，培养规模不同及工艺参数细微差异均较大程度地影响抗体半乳糖基化水平。现有培养工艺中，调节糖型比例的方法主要有：培养基筛选、添加糖型调节剂以及培养工艺优化。虽然这几种方法都可以实现调整糖型的目的，但是在调节糖型比例的过程中，其它产品的质量参数(如电荷异构体比例，磷酸化水平)往往会受到影响，从而影响产品的质量控制。
[0005]基于目前在制备单克隆抗体或者融合蛋白类药物存在的问题，专利技术人发现通过在补料培养基中添加合适用量的半胱氨酸，可以调节糖型G0F、G1F、G2F比例，提高蛋白药物的半乳糖基化水平；同时增强了工艺的可控性及重现性，使产品的糖基化水平与原研制剂保持一致；在达到调节半乳糖基化修饰的同时，其他抗体质量参数可保持不变。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提供了一种调节蛋白类药物半乳糖基化水平的CHO细胞培养方法。
[0007]在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种调节蛋白类药物半乳糖基化水平的CHO细胞培养方法。根据本专利技术的实施例，所述方法不仅可以通过调整半胱氨酸的补料量，调节蛋白类药物的半乳糖基化水平，而且不改变药物的其他关键质量属性。本培养方法操作简单，适合大规模生产。
[0008]本专利技术的上述技术目的是通过下述技术方案实现：
[0009]一种调节蛋白类药物半乳糖基化水平的CHO细胞培养方法，包括基础培养阶段和补料培养阶段，所述的补料培养阶段除补加补料培养基外，还补加L
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半胱氨酸。
[0010]在本专利技术的一些实施方案中，所述的L
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半胱氨酸可以在补料培养阶段，与补料培养基同时补加，补加量为1.2～4.8mmol/L；在本专利技术的一些实施方案中，L
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半胱氨酸的补加量，优选1.5～3.6mmol/L，更优选1.8～2.1mmol/L。专利技术人在研究过程中发现，选择合适的L
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半胱氨酸补加量，可以调节半乳糖基化糖型比例至目标水平。当L
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半胱氨酸的补加量过低时，即使在培养过程中添加糖型调节剂，也不能达到在调节半乳糖基化糖型比例的同时，而不影响产品的其他关键质量参数；而当L
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半胱氨酸的补加量高于此浓度范围时，半乳糖基化糖型改善的比例过于失衡，G0F比例过低，G1F和G2F过高，也不能达到目标的糖型比例，与原研制剂的糖基化类型和比例保持一致。
[0011]在本专利技术的一些实施方案中，所述的L
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半胱氨酸还可以在基础培养阶段和补料培养阶段分别补加，且在基础培养阶段补加量为0.3～2.0mmol/L，在补料培养阶段补加量为0.6～1.8mmol/L。专利技术人发现，在基础培养阶段和补料培养阶段分别补加L
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半胱氨酸，同样可以达到改善蛋白类药物半乳糖基化水平的目的。
[0012]优选地，所述的L
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半胱氨酸在补料培养阶段补加，可以使得整个培养工艺操作更简单，有利于维持营养物质的浓度在一定水平，不会出现初期营养物质浓度偏高，后期营养物质浓度偏低的情况，确保工艺的稳定性。
[0013]在本专利技术的一些实施方案中，所述的补料培养阶段还补加L
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酪氨酸和L
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色氨酸。专利技术人在研究过程中发现L
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酪氨酸和L
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色氨酸在本专利技术的技术方案中主要是用于提供细胞生长所需的营养物质，但不能用于改善药物的半乳糖基化比例。
[0014]在本专利技术的一些实施方案中，所述的L
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酪氨酸的补加量为2.0～2.8mmol/L，所述的L
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色氨酸的补加量为0.2～0.6mmol/L。
[0015]在本专利技术的一些实施方案中，所述的补料培养的时间是第3天开始，每2天补料一次，直至培养结束。
[0016]在本专利技术的一些实施方案中，细胞培养基可以包含无血清和/或无动物来源的产物或成分。在一些具体实施方案中，细胞培养基可以是化学成分确定的，其中已知所有化学
组分。如本领域技术人员所了解的，在适本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调节蛋白类药物半乳糖基化水平的CHO细胞培养方法，其特征在于，所述的培养方法包括基础培养阶段和补料培养阶段；所述的补料培养阶段除补加补料培养基外，还补加L
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半胱氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的L
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半胱氨酸可以在补料培养阶段，与补料培养基同时补加，补加量为1.2～4.8mmol/L，优选1.5～3.6mmol/L，更优选1.8～2.1mmol/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的L
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半胱氨酸还可以在基础培养阶段和补料培养阶段分别补加，在基础培养阶段补加量为0.3～2.0mmol/L，在补料培养阶段补加量为0.6～1.8mmol/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的补料培养阶段还补加L
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酪氨酸和L
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色氨酸。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李得林，黄根树，宁荣良，孟晓，高相雷，郭林峰，李晓平，陈小锋，李文佳，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：