培养、增殖和分化干细胞的方法和材料技术

本公开提供了RPE细胞和RPE单层。例如，提供了含有RPE细胞或RPE单层的组合物以及用于从例如干细胞(例如iPSC)制备RPE细胞或RPE单层的方法和材料。

Methods and materials for culture, proliferation and differentiation of stem cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】培养、增殖和分化干细胞的方法和材料相关申请的交叉引用本申请要求2018年2月23日提交的美国专利申请号62/634,580和2017年6月5日提交的美国专利申请号62/515，286的优先权。该在先申请的公开内容视为本申请公开内容的组成部分并将其全文纳入。
技术介绍
1.
本公开内容涉及诱导型多能干细胞(iPSC)和视网膜色素上皮。例如，本公开内容涉及培养、增殖和分化干细胞(例如iPSC)的方法和材料。本公开内容还涉及从干细胞(例如iPSC)制备视网膜色素上皮的方法和材料。2.背景信息基于iPSC的再生性药物的一个疾病靶标的例子是黄斑变性。黄斑变性是视网膜色素上皮(RPE)的异常。RPE功能中涉及的蛋白质突变引起遗传性黄斑变性，包括卵黄样变(bestrophinopathies)。卵黄样变，最常见的是贝斯特氏症(Best’sdisease)，其起源是Best1基因中的突变，导致RPE支持感光细胞的功能障碍，导致最终感光细胞死亡。先前已报道患病率为16,000-21,500分之一(Dalvin等,OphthalmicGenet.,Epub:1-5(2016))。虽然遗传性黄斑变性罕见，但年龄相关性黄斑变性(AMD)是第一世界国家失明的主要原因。据估计，到2050年美国将有500万例病例。AMD是一种更复杂的免疫和血管功能疾病，直接影响RPE功能。将RPE替代(RPEreplacement)作为治疗黄斑变性的治疗手段一直是近年来的一个热门焦点。干细胞技术的最新进展已产生了胚胎干细胞(ESC)和iPSC成为移植的诱人候选物。多个报告显示了用不同的分化介质将两种干细胞来源向RPE谱系分化的能力(Sonoda等,Nat.Protoc.,4:662-673(2009)；Johnson等,Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619(2015)；Brandl等,NeuroMolecularMed.,16:551-564(2014)；Idelson等,CellStemCell.,5:396-408(2009)；Carr等,Mol.Vis.,15:283-295(2009))。ESC-RPE和iPSC-RPE均显示出正常的RPE功能，包括细胞标志物，吞噬作用和色素沉着(Singh等,Ophthalmol.Vis.Sci.,54:6767-6778(2013))。
技术实现思路
本文涉及iPSC和RPE。例如，本公开内容提供了含有RPE的组合物以及培养、增殖和分化干细胞(例如iPSC)的方法和材料。例如，本公开内容提供了含有RPE的组合物以及从例如干细胞(例如iPSC)制备RPE的方法和材料。如本文所述，可用人纤维原作为无异源(非异源)、cGMP(目前药品生产质量管理规范)相容的细胞附着基质培养、分化和制造用于人类的iPSC-RPE。在一些情况下，纤维蛋白(例如纤维蛋白水凝胶)能代替纤维蛋白原来实施本文提供的方法和材料。纤维蛋白原是纤维蛋白的前体多肽，一种负责血液中凝血的蛋白。纤维蛋白原是可溶的340kDa的多肽，在人血液中以约200-400mg/dL存在。当激活凝血级联反应时，活化的凝血酶从纤维蛋白原切下两个纤维肽，产生纤维蛋白单体。纤维蛋白单体彼此具有高度亲和力，聚合形成不溶性的3D网格水凝胶。虽然不是胞外基质蛋白，纤维蛋白原已显示能促进原代血小板和内皮细胞的培养，如这些文献中所述(Spectre等,ThrombHaemost.,108:328-37(2012)；Underwood等,J.BiomaterSciPolymEd.,13:845-62(2002))。类似地，已在组织工程应用中使用3D网格水凝胶形式的纤维蛋白原。纤维蛋白凝胶显示了高度诱人的性能，包括3D网格形成，无异源来源，生物相容性和生物降解性。例如，在血管再生和脉管再生中使用纤维蛋白，利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)等细胞(Mishra等.Biomaterials,77:255-66(2016))。通常，本文的一个方面的特征是一种制备视网膜色素上皮单层的方法。该方法包括，或基本由以下组成：在具有涂覆纤维蛋白原的表面的容器中培养干细胞，其中表面涂有多于3μg/mL纤维蛋白原，其中细胞与纤维蛋白原接触，其中细胞形成视网膜色素上皮单层。干细胞可以是诱导型多能干细胞(例如人诱导型多能干细胞)。容器可以是培养皿(例如培养瓶)。表面可包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、混合纤维素、PTFE、PDMS、PET、玻璃、聚L-赖氨酸涂层或其组合。纤维蛋白原可以是人纤维蛋白原。可用约3-250μg/mL纤维蛋白原涂覆表面。可用约15-250μg/mL纤维蛋白原涂覆表面。可用约25-250μg/mL纤维蛋白原涂覆表面。可用约50-250μg/mL纤维蛋白原涂覆表面。可用约75-250μg/mL纤维蛋白原涂覆表面。可用所述纤维蛋白原涂覆表面约1-48小时。方法可包括培养细胞约7-90天以形成视网膜色素上皮单层。该方法可以是无异源的。在另一个方面，该说明书提供了一种视网膜植入物，其包括视网膜色素上皮单层，其中视网膜色素上皮单层根据本文描述的方法产生。在另一个方面，本文涉及一种治疗眼部疾病的方法。该方法包括或主要由以下组成：将包括视网膜色素上皮单层的视网膜植入物移植入哺乳动物的眼部，其中视网膜色素上皮单层是根据本文所述的方法制备的。眼部疾病可以是黄斑变性。哺乳动物可以是人。在另一个方面，说明书公开了一种在培养物中维持干细胞的方法。该方法包括，或主要由以下组成：在表面涂覆有纤维蛋白原的容器中培养干细胞，其中用大于250μg/mL的纤维蛋白原涂覆表面，其中干细胞与纤维蛋白原接触，其中干细胞在至少一次传代后维持分化成外胚层、内胚层和中胚层起源的细胞的能力。干细胞可以是诱导型多能干细胞。干细胞可以是人诱导型多能干细胞。容器可以是培养皿。容器可以是培养瓶。表面可包含聚苯乙烯、聚碳酸酯、混合纤维素、PTFE、PDMS、PET、玻璃、聚L-赖氨酸涂层或其组合。纤维蛋白原可以是人纤维蛋白原。表面可以是用约250-5000μg/mL纤维蛋白原涂覆的表面。表面可以是用约300-900μg/mL纤维蛋白原涂覆的表面。表面可以是用约350-750μg/mL纤维蛋白原涂覆的表面。表面可以是用约400-600μg/mL纤维蛋白原涂覆的表面。表面可以是用约450-550μg/mL纤维蛋白原涂覆的表面。表面可以是用所述纤维蛋白原涂覆约1-48小时的表面。方法可包括培养细胞约2-90天。该方法可以是无异源的。干细胞可以形成内皮细胞。干细胞可形成上皮细胞(例如RPE细胞)。纤维蛋白原可以是自体获得。在另一个方面，说明书公开了一种在培养物中维持干细胞的方法。该方法包括，或主要由以下组成：在具有涂覆有纤维蛋白原的表面的容器中培养干细胞，其中用大于3μg/mL的纤维蛋白原涂覆表面，其中干细胞与纤维蛋白原接触，其中干细胞在至少一次传代后维持分化成外胚层、内胚层和中胚层起源的细胞的能力。干细胞可以是诱导型多能干细胞。干细胞可以是人诱导型多能干细胞。容器可以是培养皿。容器可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备视网膜色素上皮单层的方法，其中所述方法包括在具有涂覆有纤维蛋白原的表面的容器中培养干细胞，其中所述表面涂覆有多于3μg/mL的纤维蛋白原，其中所述细胞与所述纤维蛋白原接触，和其中所述细胞形成所述视网膜色素上皮单层。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170605 US 62/515,286;20180223 US 62/634,5801.一种制备视网膜色素上皮单层的方法，其中所述方法包括在具有涂覆有纤维蛋白原的表面的容器中培养干细胞，其中所述表面涂覆有多于3μg/mL的纤维蛋白原，其中所述细胞与所述纤维蛋白原接触，和其中所述细胞形成所述视网膜色素上皮单层。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是诱导型多能干细胞。


3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述干细胞是人诱导型多能干细胞。


4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述容器是培养皿。


5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述容器是培养瓶。


6.如权利要求1-5任一所述的方法，其中所述表面包含聚苯乙烯、聚碳酸酯、混合纤维素、PTFE、PDMS、PET、玻璃、聚L-赖氨酸涂层或其组合。


7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述纤维蛋白原是人纤维蛋白原。


8.如权利要求1-7任一所述的方法，其中用约3-250μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


9.如权利要求1-8任一所述的方法，其中用约15-250μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


10.如权利要求1-9任一所述的方法，其中用约25-250μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


11.如权利要求1-10任一所述的方法，其中用约50-250μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


12.如权利要求1-11任一所述的方法，其中用约75-250μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


13.如权利要求1-12任一所述的方法，其中用所述纤维蛋白原涂覆所述表面约1-48小时。


14.如权利要求1-13任一所述的方法，其中所述方法包括培养所述细胞约7-90天形成所述视网膜色素上皮单层。


15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法是无异源的。


16.一种包含视网膜色素上皮单层的视网膜植入物，其中所述视网膜色素上皮单层是根据权利要求1-15任一所述的方法产生的。


17.一种治疗眼病的方法，其中所述方法包括将包含视网膜色素上皮单层的视网膜植入物植入哺乳动物的眼部，其中所述视网膜色素上皮单层是根据权利要求1-15任一所述的方法产生的。


18.如权利要求17所述的方法，其中所述眼病是黄斑变性。


19.如权利要求17-18中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。


20.一种在培养物中维持干细胞的方法，其中所述方法包括在具有纤维蛋白原涂覆的表面的容器中培养所述干细胞，其中所述表面涂覆了大于250μg/mL的纤维蛋白原，其中所述干细胞与所述纤维蛋白原接触，和其中所述干细胞在至少一次传代后维持分化成外胚层、内胚层、和中胚层起源的细胞的能力。


21.如权利要求20所述的方法，其中所述干细胞是诱导型多能干细胞。


22.如权利要求20-21中任一项所述的方法，其中，所述干细胞是人诱导型多能干细胞。


23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，所述容器是培养皿。


24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中，所述容器是培养瓶。


25.如权利要求20-24中任一所述的方法，其中所述表面包含聚苯乙烯、聚碳酸酯、混合纤维素、PTFE、PDMS、PET、玻璃、聚L-赖氨酸涂层或其组合。


26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述纤维蛋白原是人纤维蛋白原。


27.如权利要求20-26任一所述的方法，其中用约250-5000μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


28.如权利要求20-27任一所述的方法，其中用约300-900μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


29.如权利要求20-28任一所述的方法，其中用约350-750μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


30.如权利要求20-29任一所述的方法，其中用约400-600μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


31.如权利要求20-30任一所述的方法，其中用约450-550μg/mL纤维蛋白原涂覆所述表面。


32.如权利要求20-31任一所述的方法，其中用所述纤维蛋白原涂覆所述表面约1-48小时。


33.如权利要求20-32任一所述的方法，其中所述方法包括培养所述细胞约2-90天。


34.如权利要求20-33中任一项所述的方法，其中所述方法是无异源的。


35.一种在培养物中维持干细胞的方法，其中所述方法包括在具有纤维蛋白原涂覆的表面的容器中培养所述干细胞，其中所述表面涂覆了大于3μg/mL的纤维蛋白原，其中所述干细胞与所述纤维蛋白原接触，和其中所述干细胞在至少一次传代后维持分化成外胚层、内胚层、和中胚层起源的细胞的能力。


36.如权利要求35所述的方法，其中所述干细胞是诱导型多能干细胞。


37.如权利要求35-36中任一项所述的方法，其中，所述干细胞是人诱导型多能干细胞。


38.如权利要求35-37中任一项所述的方法，其中，所述容器是培养皿。


39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中，所述容器是培养瓶。


40.如权利要求35-39任一所述的方法，其中所述表面包含聚苯乙烯、聚碳酸酯、混合纤维素、PTFE、PDMS...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·D·玛莫斯坦恩，J·K·甘地，T·J·克努森，M·S·希尔，J·S·普利多，
申请(专利权)人：梅约医学教育与研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US