一种姜黄细胞悬浮培养液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种姜黄细胞悬浮培养液及其应用，以姜黄基部为外植体，进行优良愈伤组织的诱导，优良愈伤组织经过多次继代培养转入液体培养基，继而进行悬浮培养条件的筛选同时检测目标产物双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量，从而建立了姜黄愈伤组织悬浮培养体系，为通过姜黄细胞悬浮培养提取双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素含量的产业化生产奠定基础。

A suspension culture medium of Curcuma longa cells and its application

【技术实现步骤摘要】
一种姜黄细胞悬浮培养液及其应用
本专利技术属于植物细胞培养
，具体涉及一种姜黄细胞悬浮培养液及其应用。
技术介绍
姜黄素是姜黄中主要活性成分之一，可通过诱导恶性肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡及对肿瘤生长各期的抑制效应来发挥其抗癌作用，目前临床上已有相关应用。但姜黄素多从姜黄根茎中进行有机提取，得率低，成本高。提取方法可见CN41-1434/ts.2019.14.049、10.19694/i.cnki.issn2095-2457.2019.07.038等。现有技术中主要集中在对姜黄的愈伤组织培养和无性快繁体系的建立；对姜黄中活性成份的提取及其药理研究。本领域普通技术人员可知，植物细胞悬浮培养途径生产次生代谢产物是目前中药生产中的重要技术路线，但目前在姜黄研究中，尚无建立悬浮培养体系以提取姜黄素及其衍生物的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种姜黄细胞悬浮培养液及其应用。本专利技术的技术方案如下：一种姜黄细胞悬浮培养液，pH＝5.7-5.9，以MS基本培养基为溶剂，其中含有如下浓度的组分：2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0.5-2.0mg/L激动素(KT，kinetin)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)或苯基噻二唑基脲(TDZ)0.5-2.0mg/L蔗糖、果糖或蔗糖20-40g/L。在本专利技术的一个优选实施方案中，以MS基本培养基为溶剂，其中含有如下浓度的组分：2，4-二氯苯氧基乙酸0.5-2.0mg/L苯基噻二唑基脲0.5-2.0mg/L果糖20-40g/L。进一步优选的，其pH＝5.8，以MS基本培养基为溶剂，其中含有如下浓度的组分：2，4-二氯苯氧基乙酸0.4-0.6mg/L苯基噻二唑基脲1.8-2.0mg/L果糖28-32g/L。更进一步优选的，以MS基本培养基为溶剂，其中含有如下浓度的组分：2，4-二氯苯氧基乙酸0.5mg/L苯基噻二唑基脲2.0mg/L果糖30g/L。本专利技术的另一技术方案如下：一种姜黄细胞的悬浮培养方法，包括如下步骤：(1)以姜黄基部为外植体，诱导培养获取姜黄愈伤组织；(2)配制权利要求1至4中任一权利要求所述的一种姜黄细胞悬浮培养液；(3)将上述姜黄愈伤组织在所述姜黄细胞悬浮培养液中进行悬浮培养；(4)收获细胞，测定双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素含量。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述姜黄愈伤组织与所述姜黄细胞悬浮培养液的比例为0.8-1.2g∶38-42mL。进一步优选的，所述悬浮培养的条件为：摇床转速为100-120rpm，温度为23-27℃，每8-10d更换一次所述姜黄细胞悬浮培养液，23-25d后收获。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术以姜黄基部为外植体，进行优良愈伤组织的诱导，优良愈伤组织经过多次继代培养转入液体培养基，继而进行悬浮培养条件的筛选同时检测目标产物双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量，从而建立了姜黄愈伤组织悬浮培养体系，为通过姜黄细胞悬浮培养提取双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素含量的产业化生产奠定基础。2、本专利技术中中添加浓度为30g/L的果糖时，双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素含量均达到最大值。附图说明图1为本专利技术实施例1中的悬浮培养的姜黄细胞生长曲线。图2为本专利技术实施例1中的不同碳源对悬浮培养的姜黄细胞的双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素含量的影响曲线图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1试验材料：姜黄(CurcumalongaL.)，由广西药用植物研究所提供。姜黄细胞姜黄素类有效成分的测定方法为现有技术超声波萃取法。具体方法为：用10mL80％的分析纯甲醇超声波提取60min，在4℃条件下4000rpm离心10min，收取上清液，在40℃条件下旋转蒸发提取液中甲醇，然后用氮气吹干。加入2mL色谱甲醇溶解摇匀，在4℃条件下10000rpm离心20min，上清液用0.22μm滤膜过滤，储存在-20℃冰箱中备用。色谱条件：色谱柱为Inertsil-ODSC18(250×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)，0.2％乙酸(B)；流速：1.0ml/min；检测波长：425nm；柱温：30℃，进样量100μL。采用梯度洗脱，0-15min，53-60％A；18minend。姜黄愈伤组织的获得采用现有技术，从姜黄基部诱导获得，诱导培养基为MS基本培养基+1.0mg/L2，4-D+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，25℃，同培养基及培养条件继代培养3次后，转入悬浮培养。姜黄细胞悬浮培养体系的建立及培养方法材料：选取固体培养基上淡黄色、生长状态良好、质地疏松的愈伤组织。以原有固体培养基配方及培养条件(诱导培养基为MS基本培养基+1.0mg/L2，4-D+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，25℃，摇床转速110rpm)每8-10天更换一次培养基，30天后观察记录其生长情况，结果如图1所示，表明姜黄细胞悬浮培养最佳周期为24d。以进行后续的调控研究中所采用的培养液配方及培养条件为：MS基本培养基0.5mg/L2，4-D、KT(0.5、2.0mg/L)、6-BA(0.5、2.0mg/L)和TDZ(0.5、2.0mg/L)进行配比组合及不同碳源来研究。主要考察指标：悬浮培养细胞量、培养液状态和姜黄素含量。双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素以超声波萃取，含量用液相色谱(HPLC)测定。激素配比对悬浮培养细胞生长和碳源对姜黄素含量的影响表1不同激素组合对姜黄悬浮培养细胞生长的影响序号激素组合(mg/L)细胞量培养液颜色及清澈度11/2MS+2，4-D0.5+KT0.5较少暗黄，清透21/3MS+2，4-D0.5+KT0.5多淡黄，清透3MS+2，4-D0.5+KT0.5多淡黄，浑浊4MS+2，4-D0.5+KT2.0较少暗黄，清透5MS+2，4-D0.5+6-BA0.5较少淡黄，清透6MS+2，4-D0.5+6-BA2.0少淡黄，清透7MS+2，4-D0.5+TDZ0.5多淡黄，清透8MS+2，4-D0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种姜黄细胞悬浮培养液，其特征在于：pH＝5.7-5.9，以MS基本培养基为溶剂，其中含有如下浓度的组分：/n2，4-二氯苯氧基乙酸 0.5-2.0mg/L/n激动素、6-苄氨基嘌呤或苯基噻二唑基脲 0.5-2.0mg/L/n蔗糖、果糖或蔗糖 20-40g/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种姜黄细胞悬浮培养液，其特征在于：pH＝5.7-5.9，以MS基本培养基为溶剂，其中含有如下浓度的组分：
2，4-二氯苯氧基乙酸0.5-2.0mg/L
激动素、6-苄氨基嘌呤或苯基噻二唑基脲0.5-2.0mg/L
蔗糖、果糖或蔗糖20-40g/L。


2.如权利要求1所述的一种姜黄细胞悬浮培养液，其特征在于：以MS基本培养基为溶剂，其中含有如下浓度的组分：
2，4-二氯苯氧基乙酸0.5-2.0mg/L
苯基噻二唑基脲0.5-2.0mg/L
果糖20-40g/L。


3.如权利要求2所述的一种姜黄细胞悬浮培养液，其特征在于：其pH＝5.8，以MS基本培养基为溶剂，其中含有如下浓度的组分：
2，4-二氯苯氧基乙酸0.4-0.6mg/L
苯基噻二唑基脲1.8-2.0mg/L
果糖28-32g/L。


4.如权利要求3所述的一种姜黄细胞悬浮培养液，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建福，李洁，杨晨，王明元，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建;35