本发明专利技术公开了一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒；所述转移质粒为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen质粒。该重组慢病毒安全高效毒副作用小成本低，将其应用于HIV表型耐药检测中，能为临床上合理有效地选用抗HIV药物提供重要参考依据。该转移质粒报告基因Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV启动子控制报告基因Luciferase与ZsGreen的表达，使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得，将pol区导入后，多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测，通用性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及及医学分子生物学领域，具体涉及了一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用。
技术介绍
过去的数十年中，多种HIV-1抑制药物已批准入市，用于HIV感染病人的治疗。基于HIV-1逆转录酶和(或)蛋白酶的两种或多种抑制剂联合应用的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)，被公认为是治疗HIV感染病人最有效方法之一。它不仅能够提高HIV感染病人的生活质量也能降低HIV的感染风险。尽管HAART能够抑制病毒的复制和降低HIV感染的风险，但不能清除HIV-1感染者体内的病毒。因此，抗逆转录病毒疗法会因药物选择性压力下新现的耐药毒株而大打折扣。因此，很有必要监测耐药毒株并对临床精准抗病毒治疗提供指导。目前，对于HIV药物耐药性检测主要有基因型和表型耐药两种检测类型。基因型耐药检测是通过序列分析，能检出HIV-1靶基因中特定耐药相关的基因突变，因其操作简便，成本低廉，及在线的评估系统的应用，较表型耐药检测常用。但是，基因型检测不能用于解释不常见的突变或几种突变型的混合突变。表型耐药检测，能够在体外测定HIV-1抑制剂作用下的病毒产量或酶活性，能够直接测定每种抑制剂的耐药水平，而无需知晓HIV-1毒株的基因突变。因此，表型耐药检测对于HIV-1感染的病人，特别是为已经多次治疗的病人提供精准的药物指导是很有意义的。通常情况下，表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但是，这些检测需要采集献血者新鲜的外周血单个核细胞，这将耗时耗力。最近，有一些检测基于重组病毒的单环感染，或用感染性粒子进行多轮感染。尽管这些检测用于表型耐药分析有巨大的应用前景，但是，由于采用高通量定量萤火虫萤光素酶表达系统，成本还是很高昂，再就是可能存在着生物安全问题。
技术实现思路
为了解决上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒安全高效毒副作用小成本低，将其应用于HIV表型耐药检测中，能为临床上合理有效地选用抗HIV药物提供重要参考依据。该重组慢病毒带有的转移质粒，其报告基因Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV启动子控制报告基因Luciferase与ZsGreen的表达，使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得，将pol区导入后，多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测，通用性强。本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：本专利技术的专利技术思路基于以下考虑。第一，在艾滋病人临床治疗工作中，表型耐药检测能为患者个体化治疗提供参考。但是表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但是，以往的检测方法存在耗时耗力或是成本高昂，及生物安全性的问题。基于此，专利技术人开发了一种具有新的转移质粒的重组慢病毒，它具有简易操作性、较好的生物安全性及通用性。一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒；所述转移质粒为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen质粒。进一步地，所述转移质粒结构如图1所示。进一步地，所述转移质粒的构建方法，包括以下步骤：使用BamHI和KpnI双酶切pMD2.G质粒，回收酶切产物，收取119bpCMV片段；将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamHI和KpnI进行双酶切，回收4736bppHAGE-IRES-ZsGreen片段；将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒；使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-PromoterVector，回收1906bpLuciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切，回收4855bp的片段，将该片段和Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接；连接成功后，提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。进一步地，所述psPAX2m-pol质粒结构如图3所示。进一步地，所述psPAX2m-pol质粒序列如SEQIDNo.6所示。进一步地，所述psPAX2m-pol质粒的构建方法，包括以下步骤：psPAX2载体重建：利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点AgeI，获得psPAX2-1载体；利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体的酶切位点ApaI，获得psPAX2-2载体；DpnI酶切psPAX2-2载体，酶切产物转化XL10-GOLD感受态细胞，质粒提取，ApaI酶切该质粒，挑取酶切产物鉴定测序，获得psPAX2m载体，其序列如SEQIDNo.4所示；psPAX2m-pol质粒构建：利用PCR扩增pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示；用ApaI和AgeI酶切扩增后的pol片段回收并插入psPAX2m载体，得到psPAX2m-pol质粒，其序列如SEQIDNo.6所示。进一步地，所述psPAX2-1载体的序列如SEQIDNo.2所示。进一步地，所述psPAX2-2载体的序列如SEQIDNo.3所示。进一步地，所述psPAX2m载体的序列如SEQIDNo.4所示。进一步地，所述长引物法突变psPAX2载体所用的引物为AgeI-F和AgeI-R，其中，AgeI-F：CGAAGAGCTCATCAGAACAGTCAGACTCATCAAGCTTCTCTATC；AgeI-R：CTGCTAGCTATAGTTCTAGAGGTATCGGTTGTTTCGAGCTTATAG；模板为psPAX2，PCR条件：94℃预变性4min，94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸5min；所述利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体所用的引物为M-ApaI-F和M-ApaI-R；其中，M-ApaI-F：GCCTTGAGGGGCCTCCGGGGACGGCCCTTTGTGCGGGGM-ApaI-R：CCCCGCACAAAGGGGCCGTCCCGGAGCCCCCTCAAGGC；模板为psPAX2-1，PCR条件：95℃预变性2min，95℃变性30sec，55℃退火1min，68℃延伸10min，循环18次。本专利技术具有如下有益效果：一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒安全本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m‑pol质粒；所述转移质粒为pHAGE‑CMV‑Luc‑IRES‑ZsGreen质粒。
【技术特征摘要】
1.一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒
和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m-
pol质粒；所述转移质粒为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen质粒。
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述
转移质粒结构如图1所示。
3.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述
转移质粒的构建方法，包括以下步骤：使用BamHI和KpnI双酶切pMD2.G质粒，回收酶切产
物，收取119bpCMV片段；将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamHI和KpnI进行双酶切，
回收4736bppHAGE-IRES-ZsGreen片段；将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA
连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒；使用NcoI
和XbaI双酶切PGL3-PromoterVector，回收1906bpLuciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-
ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切，回收4855bp的片段，将该片段和Luciferase片段用T4
DNA连接酶进行连接；连接成功后，提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。
4.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述
psPAX2m-pol质粒结构如图3所示。
5.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述
psPAX2m-pol质粒序列如SEQIDNo.6所示。
6.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述
psPAX2m-pol质粒的构建方法，包括以下步骤：
psPAX2载体重建：利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点AgeI，获得psPAX2-1载体；
利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体的酶切位点ApaI，获得psP...
【专利技术属性】
技术研发人员：黎诚耀，翁云层，张玲，李金峰，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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