多肽、核酸及其在合成橙花叔醇糖苷上的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多肽、核酸及其在合成橙花叔醇糖苷上的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术通过分子克隆，得到了UGT91Q2基因及其表达蛋白，该蛋白能特异的催化橙花叔醇合成橙花叔醇葡萄糖苷。从而为生物合成橙化叔醇葡糖糖苷提供了新的途径。

Polypeptides, nucleic acids and their application in the synthesis of Neroli TERT alcohol glycosides

【技术实现步骤摘要】
多肽、核酸及其在合成橙花叔醇糖苷上的应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种多肽、核酸及其在催化橙化叔醇合成橙化叔醇糖苷上的应用。
技术介绍
Nerolidol(3,7,11-三甲基-1,6,10-12三萜-3-醇)，是一种天然存在的倍半萜醇，存在于各种植物的EO中，具有花香。研究发现，Nerolidol是上述植物EOs所证实的具有生物活性的化合物之一。统计数据显示，nerolidol每年的全球使用量为10至100公吨。例如，nerolidol经常用于化妆品(如洗发水和香水)和非化妆品(如洗涤剂和清洁剂)。此外，自从nerolidol作为一种安全的食品调味剂被美国食品和药物管理局批准以来，它也被广泛应用于食品工业中作为许多食品中的增味剂。近年来国内外研究发现的nerolidol具有抗氧化、抗微生物、抗生物膜、抗寄生虫、杀虫、抗溃疡、皮肤渗透增强剂、抗肿瘤、抗伤害性和抗炎等多种药理和生物活性。糖苷态香气物质是一类不具挥发性，与糖类物质通过糖苷键结合后以糖苷态形式存在的一类香气前体，具有重要的生物和药理功能。随着植物糖苷态香气前体研究的日益深入，大量糖苷态香气物质被分离并鉴定，有些还被证实具有重要的生物活性，如抗菌、抗炎和对神经的保护作用。糖苷态香气提高了游离香气物质的水溶性和稳定性，在特定的条件下，释放出人们需要的香气物质，在化妆品、食品和药物开发领域具有广泛的商业价值(如目前市场上每克香叶醇糖苷的价格为20万人民币)，成为天然产物领域研究的热门课题。在自然界中，糖苷化是植物次生代谢最为重要的修饰反应之一，糖苷物质是由UDP-糖基转移酶催化完成，糖基转移酶可将糖基从活化的供体转移到小分子香气(苷元)上，从而调节受体分子在基体的生物活性、可溶性、亚细胞定位和稳定性。植物醇系香气糖基转移酶研究进展缓慢，限制了香气糖苷在体外的高效合成，制约了香气糖苷物质在食品、化妆品及医药行业的应用。橙花叔醇，苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇，芳樟醇氧化物，4-羟基香豆素，香叶醇，及顺/反-3-己烯醇，丁香酚等香气物质存在许多植物和水果中，具有怡人的芳香和花果香，但其本身稳定性差，在空气中容易变形变质，影响了其在食品，医药方面的应用，而这些物质的糖基化产物可以显著提高其稳定性，水溶性，降低其毒性，极大地拓宽这些香气物质应用到新的领域，具有很大的商业前景。考虑到橙花叔醇在生产及生活中具有重要作用，以及糖苷态的化合物能有效的避免游离态苷元的存在的弊端，橙花叔醇糖苷化合物的化学合成效率低下，对环境污染大，且对产物没有选择性，因而这种环境友好型酶系方法合成香气糖苷化合物合成方法具有很大的应用价值。目前现有技术中急需一种合成倍半萜香气物质橙花叔醇糖苷高效生物酶及其制备方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种橙花叔醇糖苷合成相关的酶及制备方法。本专利技术的技术方案为：分离的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。编码上述多肽的核酸。进一步地，所述核酸的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。重组载体，包含有上述的核酸。重组菌株，包含有上述的核酸或重组载体。上述所述的分离的多肽或重组菌株在催化橙花叔醇合成橙花叔醇葡萄糖苷上的应用。一种合成橙花叔醇葡糖糖苷的方法，以橙化叔醇为底物，以上述所述的分离的多肽为催化剂合成橙花叔醇葡糖糖苷。进一步地，催化的温度为30℃、pH为8.5。一种合成橙化叔醇葡萄糖苷的方法，将上述所述的重组菌株接种到橙化叔醇原料中发酵，从而得到橙化叔醇葡萄糖苷。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过分子克隆，得到了UGT91Q2基因及其表达蛋白，该蛋白能特异的催化橙花叔醇合成橙花叔醇葡萄糖苷，且转化效率高达90％。从而为生物合成橙化叔醇葡糖糖苷提供了新的途径。附图说明图1为不同底物的相对酶活；横坐标为筛选的38个底物，纵坐标为相对酶活数值。以酶活数值最高的底物做为100，按照占100的百分比排序。100％的认为该酶对该底物有最大的催化效率。图2为CsUGT91Q2催化橙花叔醇合成橙花叔醇糖苷LC-MS色谱图，箭头所指的为合成的橙花叔醇糖苷的峰图，说明该酶催化橙花叔醇有糖苷产生；下方对应的为对照的峰图。图3为CsUGT91Q2催化橙花叔醇合成橙花叔醇糖苷LC-MS质谱图，385为橙花叔醇加葡萄糖加氢条件下的M值(正离子模式)，进一步验证橙花叔醇葡萄糖苷的存在。图4为不同pH值的酶活数据；横坐标为不同条件的pH，2-5为柠檬酸缓冲液、5-8为磷酸缓冲液、8-10为Tris-HCl缓冲液。纵坐标为OD595条件下酶活相对应的吸光度值A。图5为不同温度的酶活数据；横坐标为不同条件的温度，25-45℃。纵坐标为OD595条件下酶活相对应的吸光度值A。图6为不同时间的酶活数据；横坐标为不同反应时间，10-50min。纵坐标为OD595条件下酶活相对应的吸光度值A。图7为不同糖供体的酶活数据；横坐标为不同的糖供体，GA为葡萄糖醛酸，Gal为半乳糖，Glu为葡萄糖；纵坐标为OD595条件下酶活相对应的吸光度值A。相同的反应条件下加入不同的糖供体，葡萄糖具有最高的催化效率。图8为酶动力学曲线。该酶催化橙花叔醇的动力学常数Km值为19.71uM,最大反应速率Vmax为0.37nKat.mg-1,其中Km值越小，说明酶与底物之间的亲和力越强。具体实施方式实施例1UGT91Q2的克隆1、cDNA模板的获取：将茶叶的鲜叶液氮处理磨碎后，用商业化提取植物RNA试剂盒提取，之后用商业化反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。PCR引物序列：UGT91Q2F:GGTTCCGCGTGGATCCATGAACGGTGACTCCCAACAACA(SEQIDNo.3)UGT91Q2R:GGCCGCTCGAGTCGACTTAAGGGTGCTTACAAGCTTTGATTACCTCCAAC(SEQIDNo.4)反应体系：反应程序：2、重组质粒pGEX4T1-UGT91Q2的构建将完整的pGEX4T1载体根据需要进行双酶切，从而获得线性载体，之后通过商业化的试剂盒胶回收载体，获得纯化后的线性载体。用连接酶将单一的目的基因与线性载体进行连接，构建重组质粒pGEX4T1-UGT91Q2，之后转化到Trans1-T1感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中，经过菌落PCR验证后，将菌液送给通用生物有限公司完成测序工作。其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3、UGT91Q2基因的原核表达与纯化将构建成功的表达载体pGEX4T1-UGT91Q2转化到BL21感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中37℃过夜培养，在37℃条件下进行扩大培养，直至OD600＝0.6-0.8为止。冷却至16-18℃后，加入1M的IPTG在16℃培养室本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.分离的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.编码权利要求1所述的多肽的核酸。


3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


4.重组载体，包含有权利要求2或3所述的核酸。


5.重组菌株，包含有权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的重组载体。


6.权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋传奎，赵明月，张娜，王婧铭，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34