一种溶血磷脂酸酰基转移酶制造技术

本发明专利技术提供了一种溶血磷脂酸酰基转移酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核酸序列如SEQ ID NO:2所示。可将所述溶血磷脂酸酰基转移酶转入适当的载体并构建工程菌，并生产溶血磷脂酸酰基转移酶、生产sn‑2位不饱和甘油三酯，还能够提高植物种子中油脂含量。

A lysophosphatidic acid acyltransferase

【技术实现步骤摘要】
一种溶血磷脂酸酰基转移酶
本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种溶血磷脂酸酰基转移酶及其基因。
技术介绍
γ-亚麻酸在植物种子中主要以三酰甘油（triacylglycerol,TAG）的形式进行贮藏。TAG的生物合成发生在内质网膜上，通过Kennedy途径中的甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAT）和二酰甘油酰基转移酶（DGAT）3种酰基转移酶调控，由游离脂肪酸和甘油组装而成。其中，溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAT，EC2.3.1.51）是TAG组装过程中的第二个酰基转移酶，主要催化sn-2位点的酰基化反应，使溶血磷脂酸（LPA）酰基化形成磷脂酸（PA），PA可以继续进行脱磷酸反应进入TAG合成，也可以进入磷脂合成途径参与生物膜结构的形成。在植物中，TAG的不饱和脂肪酸通常位于sn-2位，这是因为LPAT具有底物选择特异性，可以在sn-2位上优先转移不饱和酰基链。LPAT活性的提高还可以减轻TAG合成过程中的反馈抑制作用，是TAG生物合成中的一个潜在限速步骤，过表达LPAT基因可以显著提高种子的含油量。因此，LPAT逐渐成为利用基因工程改良种子油脂组成、降低饱和脂肪酸比例和提高含油量等方面的研究热点。琉璃苣（BoragoofficinalisL.）为紫草科（Boraginaceae）琉璃苣属（Borago）一年生草本植物，原产于地中海沿岸和小亚细亚，近年来引入我国，已取得一定的社会和经济效益。琉璃苣的幼嫩茎叶脆而多汁，有黄瓜香味，可用作蔬菜。花通常蓝色，有很高的观赏价值，并可制作糖果、蜜饯或加入色拉、果汁饮料中。种子油脂含量丰富，具有脂肪酸组成特殊、不饱和脂肪酸含量高、含有生物活性物质等特点，对人体的新陈代谢有较好的调节作用。其中γ-亚麻酸含量约为25%，是天然植物油中含量最高的，是常用γ-亚麻酸来源植物月见草油（Oenotheraspp.）的2-2.5倍。作为一种人体无法合成的一种必需脂肪酸，γ-亚麻酸具有降血脂、杀菌、抗炎、抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗糖尿病，治疗哮喘、溃疡、特应性皮炎，以及减肥、美容等一系列生物学功能，是医药、高级营养食品、化妆品等三大领域多系列产品的主要原料，备受国内外营养及临床学界的广泛关注，市场需求广阔。然而，目前琉璃苣中还没有LPAT基因克隆及功能研究的报导。
技术实现思路
针对现有技术中的问题，本专利技术克隆了琉璃苣中的LPAT基因，可用于提高琉璃苣种子中γ-亚麻酸的油脂含量，提高琉璃苣的抗逆性。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAT），其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。优选的，所述溶血磷脂酸酰基转移酶的编码基因，简称BoLPAT基因，如SEQIDNO:2所示。上述溶血磷脂酸酰基转移酶编码基因在生产溶血磷脂酸酰基转移酶的应用、在生产sn-2位不饱和甘油三酯中的应用或提高植物种子，尤其是琉璃苣种子中油脂含量中的应用。上述溶血磷脂酸酰基转移酶在生产sn-2位不饱和甘油三酯中的应用。所述溶血磷脂酸酰基转移酶的编码基因可以通过现有技术获得相应的载体转染到适当的原核或真核微生物中，如大肠杆菌、农杆菌或者酵母，获得能够表达该溶血磷脂酸酰基转移酶的工程菌，通过发酵获得该溶血磷脂酸酰基转移酶，该酶可以用于催化底物合成sn-2位不饱和甘油酯；或者通过在发酵过程中添加适当的底物使工程菌发酵获得sn-2位不饱和甘油酯。所述溶血磷脂酸酰基转移酶的编码基因还可以用于提高植物种子中油脂含量，尤其是sn-2位不饱和甘油三酯含量。比如，通过适当的诱导条件，增加溶血磷脂酸酰基转移酶基因的表达量；再比如，通过基因工程的手段将植物中的溶血磷脂酸酰基转移酶基因加倍，获得溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达量高的转基因作物，从而提高植物种子中油脂含量，特别是sn-2位不饱和甘油三酯含量。优选的，所述诱导条件为水渍或缺氧胁迫、干旱胁迫、高盐胁迫或生长调节剂处理。所述生长调节剂选自生长素类、细胞分裂素类或脱落酸类中的至少一种。一种包含如权利要求1所述的溶血磷脂酸酰基转移酶的转基因植物。所述植物可以是双子叶植物或单子叶植物。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种溶血磷脂酸酰基转移酶及其编码基因。该酶和基因能够用于提高植物种子中油脂含量。附图说明图1为BoLPAT基因克隆的凝胶电泳图，M-DL2000，S-BoLPAT；图2为LPAT的聚类分析图；图3为BoLPAT酵母表达载体构建示意图；图4为BoLPAT基因在琉璃苣叶片中受H2O（图4A）、NaCl（图4B）、6-BA（图4C）、ABA（图4D）和PEG4000（图4E）胁迫处理的不同时间表达变化分析与极差分析（图4F）。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1BoLPAT基因克隆1.RNA的提取和cDNA的合成取适量琉璃苣叶片组织材料在液氮中研磨，依据百泰克公司多糖多酚植物RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，利用NanoDrop2000进行含量测定和1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。利用无RNA酶的脱氧核糖核酸酶（DNase）对所提取的RNA进行消化，去除样品中的脱氧核糖核酸（DNA）。利用TaKaRa公司PrimeScript反转录酶将RNA反转录为第一链互补链DNA（cDNA）。反转录的反应条件及程序均按照Takara公司的PrimeScript反转录试剂盒说明书进行。将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。基因克隆通过RT-PCR对BoLPAT进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为Pyrobestpolymerase(TaKaRa)，反应体系如下：cDNA4.0μL，10×PyrobestBuffer5μL，2mmol·L−1dNTP2μL，Pyrobest酶0.5μL，10μmol上下游引物各2.0μL，终体积为50μL。反应程序：94℃预变性7min，然后进行30个循环：94℃30s，55℃30s，72℃90s，循环结束后72℃10min延伸反应，4℃保温。扩增基因全长所用引物为：BoLPAT-FP：5’-ATGTCGATTGCAGCAGC-3’（SEQIDNO:3）；BoLPAT-RP：5’-CTACAGTTGTTTATCTTCCGAG-3’（SEQIDNO:4）。以1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图1所示，其产物大小为1164bp，对扩增所得目的片段进行切胶回收。将回收的PCR产物与测序载体pMD19-T(TaKaRa)连接后，转化DH5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上进行筛选，再经菌落PCR检测后选择阳性克隆进行测序，其核酸序列如SEQIDNO:2所示，可以编码如SEQIDNO:1所示的长度为387的氨基酸序列。将该基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与紫草科蓝蓟（Echiumpitardii）的同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶血磷脂酸酰基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种溶血磷脂酸酰基转移酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.一种如权利要求1所述的溶血磷脂酸酰基转移酶的编码基因。


3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，如SEQIDNO:2所示。


4.一种如权利要求2或3任一所述的溶血磷脂酸酰基转移酶编码基因的载体或工程菌。


5.一种如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭溆，孙金月，王新坤，刘超，王青，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农产品研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37