RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法技术

本发明专利技术涉及RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用,通过在白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。本发明专利技术还提供了一种改变草莓果实颜色的育种方法，包括在白果草莓植株中过表达RAP基因的步骤。本发明专利技术提供了RAP基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用RAP基因过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。

Application of rap gene and breeding method of changing strawberry fruit color

【技术实现步骤摘要】
RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法
本专利技术涉及草莓育种
，具体的，涉及RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法。
技术介绍
草莓(Fragariaananassa)为蔷薇科草莓属多年生草本植物，具有丰富的营养价值，位居世界小浆果生产之首。果实色泽是草莓育种的重要目标之一，而花青素是草莓果实变红的主要色素。植物细胞以苯丙氨酸为前体，在细胞质中经多步酶促反应合成花青素并储存于液泡中。花青素生物合成受两类基因的控制，分别称为结构基因和调节基因，其中结构基因在花青素合成途径中编码了一系列生物合成酶，且合成途径在各物种中非常保守，大致分为以下阶段：第一阶段前体苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4香豆酰辅酶A连接酶(4CL)的作用下转化成4-香豆酰CoA；第二阶段是4-香豆酰CoA和丙二酰CoA在查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄烷酮3’-羟化酶(F3’H)的作用下合成二氢黄烷醇；第三阶段是在二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、类黄酮糖基转移酶(UFGT)的作用下生成花青素。其中黄酮醇合酶(FLS)作为一个分支途径可将二氢黄烷醇形成黄酮醇，无色花色素还原酶(LAR)和花青素还原酶(ANR)可催化原花青素的形成。花青素合成途径的结构基因主要受到调节基因在转录水平上的调控，其中研究最透彻的是R2R3-MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40重复蛋白三者组成的复合体，称为“MBW”(MYB-bHLH-WD40)复合体。例如，R2R3-MYB转录因子MYB10在苹果、桃、油桃、樱桃和梨中均调控了果实颜色。在草莓中，多篇文章证实Fa/FvMYB10是正向调控果实颜色的关键转录因子，并且FvMYB10与FvbHLH33可能形成复合体促进结构基因的转录。最新研究发现因自然突变引起FvMYB10第12位氨基酸从W变为S，导致不同草莓生态型间红果(如Ruegen)和白果(如YellowWonder、Hawaii4)的差异。具体来说，野生型白果森林草莓‘YellowWonder’(YW)和‘Hawaii4’(H4)均有红色叶柄、淡黄色的果皮、白色的果肉和瘦果；相反，野生型红果森林草莓‘Ruegen’具有红色叶柄、红色的果皮、白色的果肉和红色的瘦果，且果皮和瘦果着色是从果实发育后期的转色期开始的。对于FveMYB10来说，Ruegen是一个真正的野生型，而YellowWonder相当于该基因的缺失突变体。除受合成途径的调控外，花青素的修饰和运输也直接影响了花青素最终的积累水平。花青素的稳定性受到糖基化、甲基化和乙酰化等修饰的调控。花青素在细胞质合成后需要运输到液泡中储存，因此花青素的运输也是调控花青素积累的重要环节。以玉米ZmMRP3为代表的MRP，以拟南芥TT12为代表的MATE，以及谷胱甘肽S-转移酶(GST，glutathioneS-transferase)都具有运输花青素的作用。不同物种中的GST蛋白都可作为搬运蛋白(carrier)介导花青素的运输过程，如矮牵牛的AN9基因、玉米的BZ2基因以及拟南芥的TT19基因，其功能缺失后植株所有组织的花青素含量都显著下降。在桃中，GST编码基因Riant调控了桃花杂色。此前，Luoetal.，通过ENU诱变YellowWonder获得一个具有绿叶叶柄的突变体rap，但它实际上是rapmyb10双突变体。基因克隆结果表明RAP编码GST蛋白，是草莓营养器官和果实着色的关键转运蛋白。现有结果表明，在草莓果实成熟过程中，FveMYB10诱导花青素合成酶和RAP基因大量表达，从而引起花青素积累，使果实着色；据此推断在FveMYB10缺失情况下，由于花青素合成受阻，RAP基因过表达也不会使白果草莓着色。
技术实现思路
专利技术人意外地发现将RAP基因连接到过表达载体PK7WG2D上，并稳定转化于RAP基因突变的白果森林草莓突变体中，果实颜色变红。基于此，本专利技术提供了RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用，通过在白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。进一步，所述草莓为森林草莓。本专利技术还提供了一种改变草莓果实颜色的育种方法，包括在白果草莓植株中过表达RAP基因的步骤。进一步，具体步骤为在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因，并将所述愈伤组织培育成植株。进一步，在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因的方法为：通过gateway反应将RAP基因整合到过表达载体pK7WG2D中，并将整合有RAP基因的过表达载体pK7WG2D-RAP转入白果草莓的愈伤组织中。进一步，通过农杆菌转化法将所述整合有RAP基因的过表达载体pK7WG2D转入白果草莓的愈伤组织中。进一步，所述草莓为森林草莓。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了RAP基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用RAP基因的过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。附图说明图1为本专利技术不同森林草莓的植株、花和心皮的形态，其中(a)、(b)(c)、(d)分别为YW5AF7、rap、RAP-ox；rap和Ruegen的植株、花和心皮的形态，其中心皮的标尺为20μm，图(e)为rap以及RAP-ox；rap叶柄的表皮和横切图；图2为本专利技术不同森林草莓果实照片，其中(a)、(b)(c)、(d)分别为YW5AF7、rap、RAP-ox；rap和Ruegen成熟果实的表型，标尺为3mm；图3为本专利技术YW5AF7、rap、RAP-ox；rap和Ruegen的叶柄以及果实中花青素的含量图；图4为本专利技术YW5AF7和RAP-ox；rap叶柄和果实中花青素的HPLC色谱图，其中图4(a)为叶柄中花青素的色谱图，图4(b)为果实中花青素的色谱图，其中x轴表示时间，y轴表示在510nm处的吸光度，峰1为矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷，峰2为芍药素-3,5-二葡萄糖苷，峰3为矢车菊素-3-葡萄糖苷，峰4为天竺葵素-3-葡萄糖苷，峰5为芍药素-3-葡萄糖苷，峰6为矢车菊素衍生物，峰7为天竺葵素衍生物，峰8为芍药素衍生物，峰9未知；图5为RAP-ox；rap和Ruegen不同发育阶段花或果实的颜色，其中图5(a)Ruegen不同发育阶段花和果实的纵切图，图5(b)RAP-ox；rap不同发育阶段花和果实的纵切图，其中分别有阶段9(S9)、10(S10)、12(S12)及开花期(Anthesis)、授粉后第6天(6d)、第10天(10d)、第13天(13d)及转色期(Turning)的果实，比例尺分别为250μm(S9，S10，S12，Anthesis)，1mm(6d，10d，13d)及1cm(Turning)；图6为在YW5AF7果实中瞬时过表达RAP后果实的颜色，其中图6(a)为在YW5AF7果实中注射缓冲液的对照组,图6(b)为在YW5AF7果实注射含有RAP过表达载体的农杆菌重悬液；图7为RAP-ox；rap和Ruegen植株开花期和转色期的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用，其特征在于，通过在白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。/n

【技术特征摘要】
1.RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用，其特征在于，通过在白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述草莓为森林草莓。


3.一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，包括在白果草莓植株中过表达RAP基因的步骤。


4.根据权利要求3所述的一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因，并将所述愈伤组织培育成植株。


5.根据权利要求4所述的一种改变草莓果...

【专利技术属性】
技术研发人员：康春颖，高绮，骆慧枫，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42