一种拮抗解淀粉芽孢杆菌产抗真菌活性物质的提取方法技术

本发明专利技术属于活性物质提取领域，具体涉及一种拮抗解淀粉芽孢杆菌产抗真菌活性物质的提取方法。该方法通过以下步骤实现：将解淀粉芽孢杆菌种子培养物进行发酵，发酵液离心，保留沉淀，冻干后加入溶剂，超声震荡，离心，保留上清液，沉淀加入甲醇或乙醇，提取，合并上清液，旋转蒸发除掉有机溶剂，将抗菌物质粗提物加入甲醇复溶，离心，上清液纯化，梯度洗脱，220 nm检测洗脱峰，收集洗脱峰，旋蒸、冻干法得到浅棕色粉末状固体。本发明专利技术提取的物质具有广谱的抗真菌活性，且该方法提取的样品纯度高，操作简单，提取过程中能够稳定活性物质，效率高，可用于发酵放大工艺的后处理，快速累积目标抗真菌物质，适合工厂化大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种拮抗解淀粉芽孢杆菌产抗真菌活性物质的提取方法
本专利技术属于活性物质提取领域，具体涉及一种拮抗解淀粉芽孢杆菌产抗真菌活性物质的提取方法。
技术介绍
随着人们对农作物产品质量和安全性的日益重视，生物防治正在逐步取代化学农药，近年来，采用微生物及其产生的抑菌物质来防治农作物真菌病害已成为重要研究方向之一。芽孢杆菌是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，能产生多种抗菌物质，其中大部分是多肽，它们易于繁殖、适应环境能力强，具有很大的开发利用价值。解淀粉芽孢杆菌能产生多种抑制植物病原菌的抗菌物质，因而在生物防治中起着重要的作用。解淀粉芽孢杆菌还能很好的抑制多种食品防腐真菌和致病菌的生长，因此又可以作为天然防腐剂在食品行业中加以应用。目前，对解淀粉芽孢杆菌所产生的抗菌活性物质提取过程中，大多将发酵液粗提洗脱后，纯化过程中将各梯度下的洗脱液混合后浓缩，该过程需监测洗脱的各个阶段的洗脱峰活性,仅适用于实验室小试,无法进行工艺放大累积目标产物。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种拮抗解淀粉芽孢杆菌产抗真菌活性物质的提取方法。该方法提取的抗菌物质抗菌活性高，广谱性好。本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：本专利技术提供了一种拮抗解淀粉芽孢杆菌产抗真菌活性物质的提取方法，包括以下步骤：（1）将解淀粉芽孢杆菌种子培养物以4~5%接种于含有发酵培养基的发酵罐进行发酵，得到发酵液；（2）停止发酵后，转速180~220rpm，盐酸调节pH至2.0~2.2之间，离心，保留沉淀，冻干后加入1倍体积的溶剂，超声震荡，离心，保留上清液，沉淀加入1倍体积甲醇或乙醇，重复提取2次，合并上清液，旋转蒸发除掉有机溶剂，得到抗菌物质粗提物；（3）将抗菌物质粗提物按1:5~1:20比例加入甲醇复溶，离心，上清液采用C-18反相柱进行纯化，采用甲醇水溶液进行梯度洗脱，220nm检测洗脱峰，收集洗脱峰，旋蒸除掉一半溶剂，加入一倍蒸馏水，冻干法得到浅棕色粉末状固体。本专利技术所使用的所述发酵培养基由以下原料组成：含有0.5%葡萄糖、0.75%酵母粉、0.75%蛋白胨、0.5%氯化钠、0.5%硫酸铵、0.5%改性荸荠粉、0.05~0.1%消泡剂。进一步的，步骤（1）中，所述发酵的条件为：转速155rpm，培养温度33.5°C，通气量0.5~0.7L/min，培养132h。进一步的，步骤（2）中，所述盐酸的浓度为6M；所述离心均为6000~8000rpm离心10min；所述溶剂为甲醇或乙醇；所述超声震荡的时间为30min。进一步的，步骤（3）中，所述离心为10000rpm离心2min。进一步的，步骤（3）中，所述C-18反相柱的柱子尺寸26mm×300mm，填料高度200~250mm。本专利技术梯度洗脱具体为分别使用40%~60%~80%~100%甲醇水溶液各200mL进行梯度洗脱。进一步的，步骤（3）中，所述洗脱峰为收集80%甲醇洗脱峰。本专利技术所使用的改性荸荠粉通过以下方法制备而成：将荸荠清洗干净后，乙醇浸泡，待表皮溶剂挥发后，带皮磨浆，将浆料和甘油、水按照质量比1：5：20混匀，然后加入占荸荠重量0.08%的丁二酸酐，搅拌，升温至75-80℃，保温1h，然后降至室温，冷冻干燥后研磨成80目细粉即可。本专利技术的有益效果为：（1）本专利技术提取的抗真菌活性物质具有广谱的抗真菌活性，对于防治植物真菌类病害具有潜在的应用价值，且该方法提取的样品纯度高，操作简单，提取过程中能够稳定活性物质，效率高。（2）本专利技术通过收集80%甲醇洗脱峰，得到活性和纯度均提高的抗真菌活性物质,减少监测步骤,方法具有可重复性、可操作性，可用于发酵放大工艺的后处理，快速累积目标抗真菌物质，适合工厂化大规模生产。附图说明图1为实施例1提取的活性物质不同浓度梯度洗脱液平板抑制尖孢镰刀菌活性图；其中：A）60%甲醇洗脱液；B）80%甲醇洗脱液。图2为实施例1提取的抗菌物质抑制真菌菌丝生长图。图3为不同浓度抗菌物质抑制孢子萌发；其中：A）未处理（放大倍数20倍）；B）30µg/mL（放大倍数40倍）；C）60µg/mL（放大倍数40杯）具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术的技术方案作进一步的解释和说明。实施例1（1）解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensNCPSJ7所使用的菌株为中国专利2013101125809所保藏的菌株；（2）发酵培养条件：将培养好的种子培养物以5%接种于发酵培养基（含有0.5%葡萄糖、0.75%酵母粉、0.75%蛋白胨、0.5%氯化钠、0.5%硫酸铵、0.5%改性荸荠粉，0.05%消泡剂）中，发酵体积为5L发酵罐，转速155rpm，培养温度33.5°C，通气量0.7L/min，培养132h，得到发酵液；（3）停止发酵，转速180rpm，6M的盐酸调节pH至2.2之间，8000rpm离心10min，保留沉淀，冻干后加入1倍体积的甲醇或乙醇，超声震荡30min，8000rpm离心10min，保留上清液，沉淀加入1倍体积甲醇或乙醇，重复提取2次，合并上清液，旋转蒸发除掉有机溶剂，得到抗菌物质粗提物；（4）抗菌物质的纯化：将抗菌物质粗提物加入尽可能少的甲醇复溶，10，000rpm离心2min，上清液采用C-18反相柱进行纯化，柱子尺寸26mm×300mm，填料高度200mm，粗提物上样量为20mL，分别使用40%~60%~80%~100%甲醇水溶液各200mL进行梯度洗脱，220nm检测洗脱峰，收集80%甲醇洗脱峰，平板测定抑制真菌活性，合并活性洗脱峰，旋蒸除掉一半溶剂，加入一倍蒸馏水，冻干法得到浅棕色粉末状固体。对比例1（1）解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensNCPSJ7所使用的菌株为中国专利2013101125809所保藏的菌株；（2）发酵培养条件：发酵培养条件：将培养好的种子培养物以4~5%接种于发酵培养基（含有0.5%葡萄糖、0.75%酵母粉、0.75%蛋白胨、0.5%氯化钠、0.5%硫酸铵、0.5%改性荸荠粉，0.05%消泡剂）中，发酵体积为5L发酵罐，转速155rpm，培养温度33.5°C，通气量0.7L/min，培养132h，得到发酵液；（3）停止发酵，转速180rpm，6M的盐酸调节pH至2.2之间，8000rpm离心10min，保留沉淀，冻干后加入1倍体积的甲醇或乙醇，超声震荡30min，8000rpm离心10min，保留上清液，沉淀加入1倍体积甲醇或乙醇，重复提取2次，合并上清液，旋转蒸发除掉有机溶剂，得到抗菌物质粗提物；（4）抗菌物质的纯化：将抗菌物质粗提物加入尽可能少的甲醇复溶，10，000rpm离心2min，上清液采用C-18反相柱进行纯化，柱子尺寸26mm×300mm，填料高度200mm，粗提物上样量为20mL，分别使用40%~60%~80%~100本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拮抗解淀粉芽孢杆菌产抗真菌活性物质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）将解淀粉芽孢杆菌种子培养物以4~5%接种于含有发酵培养基的发酵罐进行发酵，得到发酵液；/n（2）停止发酵后，转速180~220 rpm，盐酸调节pH至2.0~2.2之间，离心，保留沉淀，冻干后加入1倍体积的溶剂，超声震荡，离心，保留上清液，沉淀加入1倍体积甲醇或乙醇，重复提取2次，合并上清液，旋转蒸发除掉有机溶剂，得到抗菌物质粗提物；/n（3）将抗菌物质粗提物按1:5~1:20比例加入甲醇复溶，离心，上清液采用C-18反相柱进行纯化，采用甲醇水溶液进行梯度洗脱，220 nm检测洗脱峰，收集洗脱峰，旋蒸除掉一半溶剂，加入一倍蒸馏水，冻干法得到浅棕色粉末状固体。/n

【技术特征摘要】
1.一种拮抗解淀粉芽孢杆菌产抗真菌活性物质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将解淀粉芽孢杆菌种子培养物以4~5%接种于含有发酵培养基的发酵罐进行发酵，得到发酵液；
（2）停止发酵后，转速180~220rpm，盐酸调节pH至2.0~2.2之间，离心，保留沉淀，冻干后加入1倍体积的溶剂，超声震荡，离心，保留上清液，沉淀加入1倍体积甲醇或乙醇，重复提取2次，合并上清液，旋转蒸发除掉有机溶剂，得到抗菌物质粗提物；
（3）将抗菌物质粗提物按1:5~1:20比例加入甲醇复溶，离心，上清液采用C-18反相柱进行纯化，采用甲醇水溶液进行梯度洗脱，220nm检测洗脱峰，收集洗脱峰，旋蒸除掉一半溶剂，加入一倍蒸馏水，冻干法得到浅棕色粉末状固体。


2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）中，所述发酵培养基由以下原料组成：含有0.5%葡萄糖、0.75%酵母粉、0.75%蛋白胨、0.5%氯化钠、0.5%硫酸铵、0.5%改性荸荠粉、0.05~0.1%消泡剂。


3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军华，陈蕾蕾，陈相艳，周庆新，裘纪莹，赵双枝，张彦昊，刘孝永，辛雪，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农产品研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37