本发明专利技术提供一种重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶C的方法。用目的基因来源于铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-plcH，CCTCC?No.M?2012425作为发酵菌株进行液体发酵来制备溶血性磷脂酶C，其制备方法包括种子培养、液体发酵培养以及粗酶液的提取。利用本发明专利技术菌株通过液体发酵来生产溶血性磷脂酶C，产酶量和酶活性高，安全性好，制酶工艺简单，成本低，易于工艺放大，在油脂精炼、磷脂改性、医疗等领域具有一定的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和微生物发酵
，具体涉及一株重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶C的方法。
技术介绍
磷脂酶C (PLC)，又可称为可定向分解磷脂生成甘油二酯和磷酸单酯，细菌来源的磷脂酶C根据底物特异性的不同主要分为磷脂酰特异性磷脂酶C (PC-PLC)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C (PI-PLC)0 PLC水解产物甘油二酯是一种生理活性物质，在细胞信号传导途径上起着第二信使的作用，能激活蛋白激酶C (PKC)而引起细胞增殖、分化、收缩、分泌和代谢等功能变化，此外还具有明显的抗血小板粘附、聚集等功能，因此又被称作溶血性磷脂 酶C。溶血性PLC对新型抗血小板药物、心脑血管疾病类药物的开发具有一定的潜在价值，对抗静脉血栓及高血压医疗方面的研究意义重大。随着对PLC研究的不断深入及工业发展的需求，PLC的应用价值已经逐渐从药品生产扩展至油脂精炼、磷脂改性、食品加工等领域。例如在油脂精炼中，利用PLA和PLC混合物进行酶法脱胶，可完全除去磷脂，比水、酸或苛性碱脱胶具有更高的油产率；食品工业中PLC可用来改善在面包在烤制时其表面产生的老化现象，缓和梨皮状表皮。近年来，随着PLC在食品、医药、饲料等领域的广泛应用，国内外学者对其进行了大量的研究。国外对PLC的研究一直处于领先水平，例如1982年Vasil等人构建了一株 P. aeruginosaPA02003 (pVB81) -CT，其所产溶血性 PLC 的酶活达到了 442. 8U/ml(Vasil ML, Berka MR, Gray GL, Nakai H. Cloning of aphosphate-regulated hemolysingene (phospholipase C)from Pseudomonasaeruginosa. Journal of Bacteriology,1982,152 :431-440. ) ；1990年Ostroff等人将构建的重组质粒pGEM2/PLC_H导入到E. coliBL21 (DE3)中，成功得到了一株产溶血性PLC的菌株，该菌株的PLC活性可达到166. 7U/ml (Ostroff RM, VasilAI, Vasil ML. Molecular comparison of a nonhemolytic and ahemolyticphospholipase C from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology,1990,172(10) :5915-5923.) ; 1997 年 Cota-Gomez 等人成功构建了 E. coli BL21 (DE3)pGEM-plcHR，该菌株可产溶血性PLC，其酶活达到24. IU/毫克(Cota-Gomez A, Vasil Al,Kadurugamuwa J,Beveridge TJ,Schweizer HP, Vasil ML. PlcRl and PlcR2are putativecalcium-binding proteins required for secretion of the hemolyticphospholipaseC of Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunity, 1997,65 :2904-2913. X 国内对磷脂酶C的研究虽起步较晚，但也取得了一定成果，例如2005年陈涛等人对筛选到的产PLC菌株Bacillus cereus Shenzhen754_l进行三次紫外线和两次Co60_ Y射线诱变处理，筛选出三株高PLC活性的诱变株，酶活分别达到14. 878、16. 450、16. 400U/ml (陈涛，王常高，刘晓辉，何东平.高产磷脂酶C菌株的诱变选育.天然产物研究与开发，2005，17 (6)712-716. ) ;2007年高林对Bacillus cereus Shenzhen 754-1进行培养条件的优化，将酶活提高至26U/mL (高林.磷脂酶C高产菌株的筛选、鉴定和培养条件的优化研究.安徽农业大学的硕士学位论文，2007. );2010年詹逸舒筛选到一株Bacillus cereus Z-13，用卵黄琼脂杯碟法测定该菌株所产生的PLC的沉淀圈(乳白色沉淀圈)，其直径可达30_，酶活达到23.31U/ml (詹逸舒.产磷脂酶C菌株的筛选及其酶学性质的研究.湖南农业大学的硕士学位论文，2010.)。与动植物来源的PLC相比，上述微生物来源的PLC具有更短的生产周期，但仍存在如下弊端如野生菌株分离纯化耗资大，大多数具有潜在病原性，在食品安全性方面存在一定隐患；基因工程菌株其构建和产酶工艺较为复杂，产酶量还有待提高。因此，目前高纯度的PLC商业化生产尚未实现。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的在于提供一株重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶C的方法。利用该菌株通过液体发酵来生产溶血性磷脂酶C，产酶量和酶活性高，安全性好，制酶工艺简单，成本低。 本专利技术的技术方案如下一株重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET_plcH，保藏编号为 CCTCCNo. M 2012425。所述重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-p IcH, CCTCC No. M 2012425由下述方法制得(I)以保藏编号为CGMCC No. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的基因组为模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其碱基序列如SEQ ID N0:1所示；(2)将步骤(I)所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表达载体pET-28a ( + )上，得到重组载体；(3)将步骤(2)所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌。本专利技术还提供了一种用上述重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH, CCTCCNo. M2012425制备溶血性磷脂酶C的方法，是以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备溶血性磷脂酶C。其具体步骤如下(I)种子培养将所述重组大肠杆菌 BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCC No.M2012425接种于种子培养基中，于30 37°C振荡培养8 12h，摇床转速150 200r/min ；(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比3 10%的接种量接种至发酵培养基，于30 37°C振荡培养4 6h小时，摇床转速150 200r/min ；再添加乳糖，于20 30°C振荡诱导培养14 22h，摇床转速150 200r/min ;最后添加甘氨酸，于相同条件下继续振荡诱导培养18 36h，发酵完毕，得到发酵液；(3)粗酶液的提取将步骤(2)所得发酵液离心；收集上清液，即为胞外粗酶液；收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液。其进一步的技术方案为步骤(I)所述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨9 Ilg,酵母粉4 6g,NaCl9 llg，其余成分为水。步骤(2)所述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨9 llg，酵母粉5 24g，甘油 0 5g，其余成分为 0. 25本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株重组大肠杆菌（Escherichia?coli）BL21（DE3）/pET?plcH，保藏编号为CCTCC?No.M?2012425。
【技术特征摘要】
1.一株重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-plcH，保藏编号为 CCTCCNo. M 2012425。2.根据权利要求I所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-pIcH, CCTCC No. M2012425，其特征在于由下述方法制得 (1)以保藏编号为CGMCCNo. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的基因组为模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其碱基序列如SEQ ID NO :I所示； (2)将步骤(I)所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表达载体pET-28a( + )上，得到重组载体； (3)将步骤(2)所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌。3.用权利要求I 2任一项所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M2012425制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备溶血性磷脂酶C。4.根据权利要求3所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于具体步骤如下 (1)种子培养将所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCC No. M2012425接种于种子培养基中，于30 37°C振荡培养8 12h，摇床转速150 200r/min...
【专利技术属性】
技术研发人员：张梁，石贵阳，赵金星，丁重阳，顾正华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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