【技术实现步骤摘要】
一种特异性结合GPC3蛋白的纳米抗体GN1及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种特异性结合GPC3蛋白的纳米抗体GN1及其制备方法和应用。
技术介绍
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖(Glypican)家族中的一员，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定附着在细胞表面。GPC3在肝癌细胞中异常高表达，但是在正常组织中表达有限，GPC3的高表达与肝癌的预后差呈正相关。此外，在肝癌患者血液中可检测出分泌型GPC3蛋白。因此，GPC3成为肝癌诊断治疗的新靶点。目前，单克隆抗体在癌症的检测及靶向治疗方面成功的应用，引起了肿瘤治疗的变革。然而，传统的单抗(150kD)分子质量过大，肿瘤组织穿透能力差，造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分，并且具有很高的免疫原性。改造的抗体很难达到原来的亲和力，阻碍了抗体检测的灵敏性。此外，完全人源化的传统抗体开发周期长，生产成本高，稳定性不够等诸多因素限制其在临床中的应用。本领域需要安全有效的靶向结合GPC3用于诊...
【技术保护点】
1.一种特异性结合GPC3蛋白的纳米抗体GN1，其特征在于：/n所述纳米抗体GN1由重链抗体的可变区组成；/n所述重链抗体的可变区包括抗原决定簇互补区和骨架区；/n所述骨架区选自由FR1、FR2、FR3和FR4以及与其具有不低于80％，优选不低于90％，更优选不低于95％，进一步优选不低于99％的同一性的氨基酸序列组成的组，所述抗原决定簇互补区选自由CDR1、CDR2和CDR3以及与其具有不低于80％，优选不低于90％，更优选不低于95％，进一步优选不低于99％的同一性的氨基酸序列组成的组；/n所述CDR1的氨基酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列，所述CDR2的氨...
【技术特征摘要】
1.一种特异性结合GPC3蛋白的纳米抗体GN1，其特征在于：
所述纳米抗体GN1由重链抗体的可变区组成；
所述重链抗体的可变区包括抗原决定簇互补区和骨架区；
所述骨架区选自由FR1、FR2、FR3和FR4以及与其具有不低于80％，优选不低于90％，更优选不低于95％，进一步优选不低于99％的同一性的氨基酸序列组成的组，所述抗原决定簇互补区选自由CDR1、CDR2和CDR3以及与其具有不低于80％，优选不低于90％，更优选不低于95％，进一步优选不低于99％的同一性的氨基酸序列组成的组；
所述CDR1的氨基酸序列具有如SEQIDNO.1所示的序列，所述CDR2的氨基酸序列具有如SEQIDNO.2所示的序列，所述CDR3的氨基酸序列具有如SEQIDNO.3所示的序列；所述FR1的氨基酸序列具有如SEQIDNO.4所示的序列；所述FR2的氨基酸序列具有如SEQIDNO.5所示的序列；所述FR3的氨基酸序列具有如SEQIDNO.6所示的序列；所述FR4的氨基酸序列具有如SEQIDNO.7所述的序列；
进一步优选的是，所述纳米抗体GN1的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.8所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1或2所述的纳米抗体GN1；优选的是，所述核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.9所示。
3.一种重组载体或包含所述重组载体的宿主细胞，所述重组载体包含与调控序列可操作地连接的权利要求3所述的多核苷酸，或包含权利要求3所述的核苷酸序列中缺失1-5个氨基酸残基的密码子和/或进行1-5个碱基对的错义突变得到的核苷酸序列。
4.一种药学组合物，所述药学组合物包含权利要求1所述的纳米抗体GN1和药学上可接受的载体，优选的是，所述药物组合物用于检测和/或治疗肝癌，更优选的是，所述肝癌为小肝癌。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(a)权利要求1所述的纳米抗体GN1；和/或包含所述纳米抗体GN1和荧光素酶氨基酸序列的融合蛋白，优选的是，所述荧光素酶氨基酸序列具有如SEQIDNO.14所示的序列，更优选的是，所述试剂盒用于检测和/或治疗肝癌，更优选的是，所述肝癌为小肝癌。
6.一种用于制备权利要求1所述纳米抗体GN1的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)免疫羊驼：使用GPC3蛋白对羊驼进行免疫；
(2)提取RNA：采用来自经免疫的羊驼的外周血来提取总RNA；
(3)纳米抗体基因库构建：采用所述总RNA构建纳米抗体基因库；
(4)淘选并鉴定：采用偶联链霉亲和素的磁珠和生物素化GPC3蛋白对纳米抗体基因库进行亲和淘选，并使用GPC3多克隆抗体通过夹心phageELISA鉴定阳性克隆；
(5)表达和纯化：挑选phageELISA信号最高的阳性克隆菌株诱导表达纳米抗体，并分离纯化得到纳米抗体GN1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
在步骤(1)中，所述GPC3蛋白为真核细胞(HEK293)表达的蛋白；所述羊驼为成年健康羊驼；和/或免疫采用皮下多点注射进行；
在步骤(2)中，采用来自经免疫的羊驼的外周血的淋巴细胞来提取总RNA；
在步骤(3)中，构建纳米抗体基因库包括如下步骤：
a.cDNA的合成：将所述总RNA反转录合成cDNA链；
b.羊驼重链抗体可变区基因的扩增：以所述cDNA链为模板，分别使用两对引物经PCR扩增获得羊驼重链抗体IgG2和重链抗体IgG3的可变区基因，所述两对应物包括由HS引物和Hanti1引物组成的第一对引物和由引物HS引物和Hanti2引物组成的第二对引物；
c.将所述重链抗体可变区基因连接到载体上：将所述重链抗体可变区基因连接到噬菌粒载体中并纯化回收包含重组载体的连接产物；优选的是，所述连接采用基于同源重组原理的试剂盒进行，所述噬菌粒载体为pComb3X载体，并且所述纯化回收使用PCR产物纯化试剂盒进行；
d.重组载体的转化：通过电击转化法将连接产物转化到大肠杆菌中并检测库容量；优选的是，所述大肠杆菌为ER2738大肠杆菌；更优选的是，所述电击转化通过如下方式进行：对于ER2738大肠杆菌和连接产物的混合物，使用Tip头轻轻搅动2-3圈避免产生气泡，加入到冷却的1.0mm电转化杯中，轻微甩动电转杯使得混合物全部进入电击区域，立刻放置电转仪，电转条件：1400-1600V，200-400Ω，10μF，3.5-4.5毫秒，立刻加入975μL预热的复苏培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：段斯亮，于声，桂雄，于亚婷，
申请(专利权)人：广西科技大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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