用于制备抗体-药物缀合物的双重缀合方法技术

本发明专利技术涉及用于制备抗体‑药物缀合物的方法，并且涉及抗体‑药物缀合物，其中治疗性部分通过可切割或不可切割的接头与一个或更多个改造半胱氨酸缀合以及与一个或更多个还原型链间半胱氨酸缀合。

A double conjugation method for the preparation of antibody drug conjugates

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备抗体-药物缀合物的双重缀合方法
本专利技术涉及用于将治疗性部分通过可切割或不可切割的接头与抗体缀合的新方法。此外，本专利技术涉及新的抗体-药物缀合物。
技术介绍
抗体-药物缀合物(antibody-drugconjugate，ADC)是新兴的一类靶向治疗剂，其中将抗体的特异性与细胞毒性分子的效力相组合。经半胱氨酸改造的抗体越来越多地用于治疗性部分(例如，药物、毒素或用于放射性同位素的螯合剂)、荧光标记或亲水性聚合物的缀合。在抗体的合适位置引入半胱氨酸残基允许控制缀合的位点，并且所获得的位点特异性缀合物比通过野生型缀合(即，通过还原型链间半胱氨酸的缀合)获得的缀合物更加同质。与野生型缀合物相比，位点特异性缀合的ADC通常表现出至少等效的体内效力、提高的药代动力学(pharmacokinetic，PK)和扩大的治疗窗。临床试验中的首个位点特异性ADC，SGN-CD33A(SeattleGenetics)，包含可切割的二肽接头(即缬氨酸-丙氨酸)和作为药物的DNA交联吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine，PBD)二聚体，其与IgG1mAbh2H12的Fc部分中重链位置S239C处的半胱氨酸连接，平均药物-抗体比(drug-to-antibodyratio，DAR)为1.9(Sutherland等，Blood，2013，122(8)，1455-1463)。这种低载药量可能不适用于每种接头药物或每种类型的癌症。对于效力较低的毒素或对于靶抗原表达较低的癌症类型，较高的DAR可能是必要的。然而，这只有在开发的晚期阶段才可变得明显，此时已将大量时间、精力和资源投入在开发在重链或轻链中具有一个改造半胱氨酸的抗体。此外，当1.9的平均DAR明显不足时，必须在抗体中改造另外的半胱氨酸，这需要新抗体开发，并且因此需要新细胞系开发，这是一个漫长的过程。另外，确定一个或更多个另外的半胱氨酸的位置不是一件微不足道的事，因为例如并不是所有位置都能够进行缀合，或者某些位置可产生具有不可接受高百分比的高分子量聚集体(highmolecularweightaggregate，HMW)的ADC。因此，仍然需要可用于容易地调整所产生ADC的DAR而无需进行全新抗体开发的新且更灵活的缀合方法，以及具有可接受的抗原结合特性、药代动力学、体内效力、治疗指数和/或稳定性的ADC。专利技术简述本专利技术涉及用于制备抗体-药物缀合物的方法，并且涉及抗体-药物缀合物，其中治疗性部分通过可切割或不可切割的接头与一个或更多个改造半胱氨酸缀合以及与一个或更多个还原型链间半胱氨酸缀合。附图简述图1.仅通过还原型链间半胱氨酸缀合的vc-seco-DUBAADC1d(DAR2.5)(上图)和通过位置HC41处改造半胱氨酸和还原型链间半胱氨酸二者缀合的vc-seco-DUBAADC1c(DAR2.6)(下图)的HIC谱。图2.使用根据本专利技术的方法用递增量的TCEP获得的DAR递增的通过位置HC41处改造半胱氨酸和还原型链间半胱氨酸二者缀合的vc-MMAEADC的HIC谱。图3.使用根据本专利技术的方法获得的DAR递增的通过位置HC41处改造半胱氨酸和还原型链间半胱氨酸二者缀合的抗PSMA-vc-seco-DUBAADC3a至3d的胱天蛋白酶3/7测定。利妥昔单抗-vc-seco-DUBA是非结合ADC对照。图4.通过位置HC41处改造半胱氨酸和还原型链间半胱氨酸二者缀合的抗5T4-vc-seco-DUBAADC1b(，DAR2.2)和1c(，DAR2.6)、仅通过还原型链间半胱氨酸缀合的ADC1d(仅随机，，DAR2.5)在ceslceKO裸鼠中的BT474异种移植物中的体内效力。图5.通过位置HC41处改造半胱氨酸和还原型链间半胱氨酸二者缀合的抗5T4-vc-seco-DUBAADC1c(DAR2.6)和仅通过还原型链间半胱氨酸缀合的抗5T4-vc-seco-DUBAADC1d(DAR2.5)的完整PK曲线。专利技术详述本专利技术涉及用于制备抗体-药物缀合物的方法，并且涉及抗体-药物缀合物，其中治疗性部分通过可切割或不可切割的接头与一个或更多个改造半胱氨酸缀合以及与一个或更多个还原型链间半胱氨酸缀合。在本说明书通篇使用的术语“抗体”是指包含两条重链和两条轻链的单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)或其抗原结合片段，其中存在至少一个链间二硫键，例如，Fab、Fab’或F(ab’)2片段。根据本专利技术的抗体可以是任何同种型，例如IgG、IgA或IgM抗体。优选地，抗体是IgG抗体，更优选IgG1或IgG2抗体。抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。优选地，抗体是人源化的。甚至更优选地，抗体是人源化或人IgG抗体，最优选人源化或人IgG1mAb。抗体可以具有κ(卡帕)或λ(拉姆达)轻链，优选κ(卡帕)轻链，即人源化或人IgG1-κ抗体。在人源化抗体中，HC和LC的可变区中的抗原结合互补决定区(complementaritydeterminingregion，CDR)来源于来自非人物种(通常是小鼠、大鼠或兔)的抗体。这些非人CDR可置于HC和LC的可变区的人框架(FR1、FR2、FR3和FR4)内。可将人FR中选定的氨基酸交换为相应的原始非人物种氨基酸以提高结合亲和力，同时保持低免疫原性。或者，将原始非人物种FR中选定的氨基酸交换为其相应的人氨基酸以降低免疫原性，同时保持抗体的结合亲和力。将这样人源化的可变区与人恒定区组合。本文中使用的术语“单克隆抗体”和“mAb”是指从基本上同质的抗体的群获得的抗体，即，除了可以以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该群的单个抗体是相同的。可通过用代表所期望抗原的肽的混合物对动物进行免疫接种来产生抗体。分离B淋巴细胞并使其与骨髓瘤细胞融合，或在存在条件化培养基和饲养细胞的情况下将单一B淋巴细胞培养数天。测试含有产生的抗体的骨髓瘤或B淋巴细胞上清液以选择合适的B淋巴细胞或杂交瘤。可通过最初由等，Nature，1975，256，495-497描述的杂交瘤方法由合适的杂交瘤制备单克隆抗体。或者，可以裂解合适B细胞或淋巴瘤的RNA，可以分离RNA，对其进行逆转录并测序。可在细菌、真核动物或植物细胞中用重组DNA方法制备抗体(参见，例如，美国专利No.4,816,567)。还可使用本领域中，例如Clackson等，Nature199，1352，624-628和Marks等，J.Mol.Biol.1991，222，581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。在本说明书通篇使用的术语“经半胱氨酸改造的抗体”是指其中已经通过基因改造技术通过用半胱氨酸替换抗体的一个或更多个氨基酸残基或者通过将一个或更多个半胱氨酸插入到一级氨基酸序列中引入一个或更多个半胱氨酸残基的抗体。在本说明书通篇使用的术语“抗体-药物缀合物(ADC)”是指如上文所定义的抗体，一个或更多个治疗性部分通过接头(接头药物)与其缀合。与抗体缀合的接头药本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于制备抗体-药物缀合物的方法，其包括以下步骤：/na.选择性地还原经半胱氨酸改造的抗体，包括使在选自以下的位置包含一个或更多个改造半胱氨酸的抗体与根据式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的化合物或其盐反应：根据Kabat编号系统的重链40、41和89，根据Eu编号系统的重链152、153、155和171，根据Kabat编号系统的轻链40和41，以及根据Eu编号系统的轻链165和168：/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170523 EP 17172450.3;20170523 EP 17172449.51.用于制备抗体-药物缀合物的方法，其包括以下步骤：
a.选择性地还原经半胱氨酸改造的抗体，包括使在选自以下的位置包含一个或更多个改造半胱氨酸的抗体与根据式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的化合物或其盐反应：根据Kabat编号系统的重链40、41和89，根据Eu编号系统的重链152、153、155和171，根据Kabat编号系统的轻链40和41，以及根据Eu编号系统的轻链165和168：



b.用链间二硫键还原剂进一步还原步骤a.中经选择性还原的抗体；以及
c.使治疗性部分通过可切割或不可切割的接头与步骤b.中经进一步还原的抗体缀合。


2.根据权利要求1所述的方法，其中根据式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的所述化合物以每摩尔量改造半胱氨酸至少1摩尔当量的量存在。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使所述经半胱氨酸改造的抗体与根据式(I)、(II)或(III)的化合物或其盐反应。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述抗体在选自重链40、41、152和153以及轻链40、41和165的位置包含一个或更多个改造半胱氨酸。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗体在选自重链41以及轻链40和41的位置包含一个或更多个改造半胱氨酸。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述链间二硫键还原剂是三(3-磺基苯基)膦、三(2-羧乙基)膦或二硫苏糖醇。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述链间二硫键还原剂以每摩尔当量抗体多于0.1摩尔当量的量存在。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗体是与选自以下的靶标结合的单特异性或双特异性抗体或者包含至少一个重链和轻链可变区的抗体片段：膜联蛋白A1、B7H4、CA6、CA9、CA15-3、CA19-9、CA27-29、CA125、CA242、CCR2、CCR5、CD2、CD19、CD20、CD22、CD30、CD3...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁迪·赫拉尔杜斯·伊丽莎白·库曼斯，
申请(专利权)人：斯索恩生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL