一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，特别涉及一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用。本发明专利技术提供的构建长片段目的基因的方法能够有效降低目的基因构建时的经济成本，同时，降低碱基突变的概率。其技术要点包括：将目的基因序列根据实际需要分段，并分别在每段的两端加入酶切位点序列，然后合成相应目标产物序列片段；利用T4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端将目标产物磷酸化；将磷酸化的目标产物退火，得到目的片段；将载体质粒酶切，所形成的粘性末端与第一步中所加入的酶切位点序列对应，并回收酶切产物，得到载体片段；将目的片段与载体片段连接，得到连接产物。

A Method of Constructing Long Fragment Target Gene by Polynucleotide Kinase and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用
本专利技术属于分子生物学
，特别涉及一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用。
技术介绍
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’羟基末端，5’磷酸末端形成磷酸二酯键连接起来，该反应为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因工程实验中，最常用连接酶是的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。其对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式使目的片段之间能够匹配。很多公司在合成引物时，若客户无特殊要求，引物的5’端都是去磷酸化的，一般只有客户要求的时候，才会给合成磷酸化的5’末端，并且需要另外收取较高的费用，这给本就价格不菲的序列合成工作又增加了一些经济负担。
技术实现思路
基于现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用，使用本方法构建长片段目的基因所需的成本较低，具有更好的经济效益。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法，包括以下步骤：S1：将目的基因序列根据实际需要分段，并分别在每段的两端加入酶切位点序列，然后合成相应目标产物序列片段；S2：利用T4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端将目标产物磷酸化；S3：将磷酸化的目标产物退火，得到目的片段；S4：将载体质粒酶切，所形成的粘性末端与步骤S1中所加入的酶切位点序列对应，并回收酶切产物，得到载体片段；S5：将目的片段与载体片段连接，得到连接产物。进一步地，在步骤S5后面依次增加S6、S7，其中，S6：将连接产物转化至宿主菌中，并进行抗性培养基培养；S7：对S6中抗性培养阳性的菌株提取质粒并测序，通过序列比对判断是否成功构建质粒。进一步地，步骤S1中，目标产物合成后，用pH为8.5，浓度为10mmol/L的Tris-HCl配制浓度为0.25nmol/L的目标产物。一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法在构建长片段目的基因中的应用。一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法在构建长片段目的基因的试剂盒中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：传统的构建长片段目的基因的方法一般分为两种，例如需要插入的目的基因片段是100bp，传统方法一是将整个100bp目的基因让生物公司合成，合成后然后插入相应的载体中，方法一合成该目的基因的成本需要1000元/OD，并且在合成的碱基大于60bp后碱基的突变率会增加，导致构建该质粒的准确性降低了，若是按照该方法构建的质粒，后期出现目的基因的突变需要额外的费用去进行修改。传统方法二是将整个100bp目的基因片段分成2段，因此需要合成的费用为200元，但是需要在2对引物的5’末端加入磷酸基团修饰需要250元/端，因此按照该方法需要的成本为700元/OD。而按照本专利技术的技术方案，将目的基因分两段合成，需要成本为120元/OD，经济负担明显减少。而且本实验的方案简单，容易操作，所涉及到的酶容易够买，并且可以多次使用。并且用该方法使得碱基突变概率得到有效控制。附图说明图1是本专利技术原理流程图；图2是目的基因序列酶切插入位点示意图；图3是Mix3-1和Mix4-1目的片段酶切插入位点示意图。具体实施方式下面将结合具体实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术披露了一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用，具体如下所示，原理流程如图1所示。实施例S1：将目的基因序列根据实际需要分段，并分别在每段的两端加入酶切位点序列，然后合成相应目标产物序列片段。本实施例中将待构建的长片段磷酸化目的基因序列分为两段，具体为:5’TCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTCGCTTCACGAGATTCCAGCAGGTCGAGGGACCTAATTAAGGGTTCCAAGCTTAAGC3’，见SEQIDNO：1。3’CCAGCTGCCATAGCTATTCGAGCGAAGTGCTCTAAGGTCGTCCAGCTCCCTGGATTAATTCCCAAGGTTCGAATTCGCCGG5’，见SEQIDNO：2。且在每段的两端分别加入酶切位点序列，如图2所示。针对两端序列分别设计引物，以引物的形式合成，之后送至第三方生工生物公司合成。引物序列如下：1F，5'TCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTCGCTTCACGAGATTCC3'，见SEQIDNO：3；2R，5'CCTGCTGGAATCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACCGTCGACC3'，SEQIDNO：4；3F，5'AGCAGGTCGAGGGACCTAATTAAGGGTTCCAAGCTTAAGC3'，SEQIDNO：5；4R，5'GGCCGCTTAAGCTTGGAACCCTTAATTAGGTCCCTCGA3'，SEQIDNO：6。将合成的引物干粉4℃离心机12000r离心5分钟后，用pH为8.5，浓度为10mmol/L的Tris-HCl配制成浓度为0.25nmol/L的目标产物，对应名称分别为Mix1-1，Mix1-2，Mix1-3，Mix1-4。S2：将配制好的目标产物磷酸化。利用T4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端磷酸化，以便后面实验进行连接反应。磷酸化反应体系如下表所示，并在37℃水浴锅中反应30分钟。2.1Mix2-1(μL)2.2Mix2-2(μL)Mix1-15Mix1-35Mix1-25Mix1-45T4DNALigasebuffer2T4DNALigasebuffer2T4PNK(10000U/ml,NEB)3T4PNK(10000U/ml,NEB)3H2O5H205Total20Total20Mix1-1与Mix1-2连接并磷酸后，得到产物Mix2-1；Mix1-3与Mix1-4连接后，得到产物Mix2-2。S3：将磷酸化的目标产物退火。将磷酸化产物从水浴锅中取出后，按照下表所示的反应体系加入annealingbuffer，三蒸水定容到25μL，在PCR仪器上95℃反应20min，然后立即拿出放室温4小时静置。若不进行下步反应可将退火产物在冷却至室温以后放在-20℃保存，退火产物放置-20℃最好不超过2个月。Mix2-1和Mix2-2经退火反应后，分别得到Mix3-1和Mix3-2两种目的片段，如图3所示。S4：将载体质粒酶切，所形成的粘性末端与步骤S1中所加入的酶切位点序列对应，并回收酶切产物，得到载体片段。本实施例中所用的质粒为LentiviruvectorpLL3.7通用载体质粒，购买自上海CPG生物科技有限公司，用NotI-HF和XhoI限制性内切酶酶切形成粘性末端，酶切体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将目的基因序列根据实际需要分段，并分别在每段的两端加入酶切位点序列，然后合成相应目标产物序列片段；S2：利用T4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端将目标产物磷酸化；S3：将磷酸化的目标产物退火，得到目的片段；S4：将载体质粒酶切，所形成的粘性末端与步骤S1中所加入的酶切位点序列对应，并回收酶切产物，得到载体片段；S5：将目的片段与载体片段连接，得到连接产物。

【技术特征摘要】
1.一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将目的基因序列根据实际需要分段，并分别在每段的两端加入酶切位点序列，然后合成相应目标产物序列片段；S2：利用T4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端将目标产物磷酸化；S3：将磷酸化的目标产物退火，得到目的片段；S4：将载体质粒酶切，所形成的粘性末端与步骤S1中所加入的酶切位点序列对应，并回收酶切产物，得到载体片段；S5：将目的片段与载体片段连接，得到连接产物。2.根据权利要求1所述的一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法，其特征在于：在步骤S5后面依次增加S6、S7，其中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚凯，覃欢，张士尧，冯源，张文良，姚浩哲，肖鹦，王佳汝，吴嘉轩，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42